Detektion Mittels Optischer Bank - Abbott Cell-Dyn 3200 System Bedienungsanleitung

Allgemeine Systemfunktionen
Flow-Zytometrie

Detektion mittels optischer Bank

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Die optische Bank enthält die Komponenten, aus denen das Flow-Zytometer
besteht. Sie ist in Abbildung 3.1 dargestellt. Die Hauptfunktion der optischen Bank
besteht in der Messung des von den passierenden Zellen durch die Durchflusskü-
vette gestreuten Lichts. Der Detektionsprozess wird in diesem Abschnitt erläutert.
Die Lichtquelle besteht aus einem vertikal polarisierten 10-mW-Helium-Neon-
Laser mit einer Wellenlänge von 632,8 nm. Der Laserstrahl passiert eine zylindri-
sche Linse, wodurch sich sein Querschnitt von der Kreisform zur Ellipse ändert.
Der Strahl wird dann durch eine 125-µm-Spaltblende gelenkt, welche die schwä-
chere Randstrahlung zurückhält. Dadurch entsteht ein gleichmäßig intensiver
Strahl von etwa 80 µm Breite. Der Zellstrom ist somit immer der gleichen Lichtin-
tensität ausgesetzt, auch wenn er innerhalb der Durchflussküvette von seiner Bahn
leicht abweicht. Eine Fokussierlinse konzentriert den fokussierten Laserstrahl auf
die Quarzdurchflussküvette.
Von der Probentransferspritze werden verschiedene Probenverdünnungen in den
Sheath-Reagenzstrom der optischen Durchflussküvette abgegeben. Die Probe wird
hydrodynamisch auf einen schmalen Strom von etwa 30 µm Durchmesser fokus-
siert. Durch diesen schmalen Strom werden die verdünnten Zellen hintereinander
angeordnet und passieren einzeln den Lichtstrahl, so dass im Messbereich der
Detektoren jeweils nur eine Zelle erfasst wird.
Da eine durchschnittliche Zelle kleiner als der fokussierte Laserstrahl ist, wird
durch die Zellen nur ein geringer Teil des Lichts gestreut. Würde das verbleibende,
nicht gestreute Licht die 0°- und 10°-Detektoren (für die Vorwärtsstreuung) errei-
chen, wäre die Elektronik übersteuert. Daher wird der nicht gestreute Lichtstrahl
im Winkel von 0° – 1° von einer Dunkelfeldscheibe zurückgehalten. Das Vorwärts-
streulicht trifft auf einen halbdurchlässigen Spiegel. Das 0°- (1° – 3°-) Streulicht
passiert den Spiegel und trifft auf den 0°-Silikon-Photodioden-Detektor. Die 10°
(7° – 10°- oder Schmalwinkel-) Streuung wird vom Spiegel auf den 10°-Silikon-
Photodioden-Detektor abgelenkt.
Die rechtwinklige Streuung passiert eine 700-µm-Spaltblende, wodurch Streulicht
von der Wandung der Durchflussküvette zurückgehalten wird. Ein Strahlenteiler
spaltet das 90°-Streulicht in zwei Teile. Ein Teil des Streulichts wird auf den 90°-
PMT (Photo-Multiplier) gelenkt. Der andere Teil passiert ein horizontal ausgerich-
tetes Polarisationsfilter. Nur Licht mit gedrehter Polarisationsebene (depolarisiertes
Licht) kann durch das Polarisationsfilter zum 90°D PMT gelangen. (Photo-Multi-
plier, PMT, sind wegen der geringen Intensität des 90°-Streulichts erforderlich.)
Die von den Detektoren aufgefangenen Lichtsignale werden in elektrische Signale
oder Impulse umgewandelt. Diese Impulse werden entsprechend ihrer Intensität
digitalisiert und pro Messwinkel in 256 Kanäle aufgeteilt.
Liegt ein Impuls der 0°- und 10°-Detektoren über der von der Hardware vorgege-
benen Schwelle, wird dieser Impuls vom Zellzähler registriert und zur weiteren
Auswertung gespeichert. Impulse, die unterhalb dieser Schwelle liegen, finden
keinen Eingang in die Zählung.
Kapitel 3
CELL-DYN ® 3200 Bedienungsanleitung
68-4284/R4 - Oktober 2002