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1. Ein hc2-Probenkonversionsröhrchen, ein konisches 10-ml-Sarstedt-Röhrchen oder ein 15-ml-VWR-
oder Corning-Röhrchen mit der entsprechenden Probenidentifikationsnummer beschriften.
2. Nur eine Probe auf einmal verarbeiten:
a. PreservCyt-Gefäß kräftig von Hand schütteln, bis die Zellen homogen verteilt sind.
b. Da sich die Zellen schnell absetzen, sofort das entsprechende Volumen der PreservCyt-Probe in
das beschriftete Röhrchen pipettieren. Die PreservCyt Solution ganz unten in ein konisches
Röhrchen geben, damit möglichst wenig Zellmaterial an den Wänden haften bleibt.
3. Jedem Röhrchen das entsprechende Volumen Probenkonversionspuffer zufügen (siehe Tabelle 1).
4. Röhrchen wieder verschließen und den Inhalt mit einem Vortex-Mischer mit Zusatzschale mischen.
Hinweis: Das Verfahren mit dem MST-Vortexer 2 wurde nicht zum Vortexen von Proben in
PreservCyt Solution mit Probenkonversionspuffer vor der Zentrifugation validiert und darf
daher für diesen Schritt nicht benutzt werden.
5. Röhrchen im Ausschwingrotor 15 ±2 Minuten bei 2900 ±150 U/min. zentrifugieren.
6. Während der Zentrifugation Mischung aus Probentransportmedium und Denaturierungsreagenz
(STM/DNR) gemäß Tabelle 2 im Verhältnis 2:1 vorbereiten.
Hinweis: Die STM/DNR-Mischung muss an jedem Testtag frisch zubereitet werden.
a. Zur Berechnung des Gesamtvolumens der benötigten STM/DNR-Mischung Ausgangsvolumen der
Probe in PreservCyt Solution als Anhaltspunkt nehmen und dann die STM- und DNR- Volumina
„pro Röhrchen" mit der Anzahl der zu testenden Proben multiplizieren (siehe Tabelle 2).
Anzahl Tests
1-2
3
4
5
6
*Die in diesen Spalten aufgelisteten Mengen dürfen den Probenröhrchen nicht direkt zugegeben werden
b. Lösung gründlich mit dem Vortexer mischen.
7. Röhrchen einzeln aus der Zentrifuge nehmen und in einen Halter oder ein Konversionsgestell stellen.
In jedem Röhrchen sollte am Grund ein pink-/orangefarbenes Pellet zu sehen sein.
Hinweis: Proben, die nach dem Zentrifugieren kein sichtbares Pellet aufweisen, können nicht für den
Test verwendet und müssen verworfen werden.
8. Individuelle Handhabung der Proben:
a. Verschlusskappe entfernen und auf ein sauberes, fusselfreies Papiertuch legen.
b. Überstand sorgfältig abdekantieren.
c. Röhrchen in ungekehrter Position halten und vorsichtig (ungefähr sechsmal) auf absorbierenden,
fusselfreien Papiertüchern abtupfen, bis keine Flüssigkeit mehr aus dem Röhrchen tropft. Jedes
Mal eine saubere Stelle auf dem Papiertuch benutzen. Das Pellet darf während des Abtupfens
nicht am Röhrchen herabrutschen.
Hinweise:
Nicht mehrmals auf dieselbe Stelle des absorbierenden, fusselfreien Papiertuchs tupfen.
•
Es ist wichtig, dass die höchstmögliche Menge an PreservCyt durch Abtupfen entfernt wird.
•
Aber es ist normal, wenn nach dem Abtupfen noch ein Rest an PreservCyt-Lösung zu sehen
ist.
d.
Röhrchen in einen Halter oder ins Konversionsgestell stellen.
Erforderliche Mengen: STM/DNR
Volumen der
STM-Volumen pro
PreservCyt
Röhrchen für
Solution
4 ml
6 ml
8 ml
10 ml
12 ml
Tabelle 2.
DNR-Volumen pro
Röhrchen für
endgültige
endgültige
STM/DNR-
STM/DNR-
*
Mischung
Mischung
120 µl
170 µl
220 µl
270 µl
320 µl
16
Ins Röhrchen
gegebene
STM/DNR-
Mischung
*
60 µl
150 µl
85 µl
225 µl
110 µl
300 µl
135 µl
375 µl
160 µl
450 µl
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