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SYSTEME DE TEST ANA COLORZYME®
POUR UTILISATION DIAGNOSTIQUE IN VITRO
RESUME ET EXPLICATION DU TEST
UTILISATION PRÉVUE: Il s'agit d'un test immuno-enzyma-
tique indirect pour la détection semi-quantitative des
anticorps anti-nucléaires dans le sérum humain. Ce
système de test doit être utilisé comme une aide à la
détection des anticorps associés aux maladies rhuma-
tismales systémiques.
Anticorps anti-nucléaire (ANA) est un terme général
utilisé pour décrire les auto-anticorps dirigés contre
diverses protéines nucléaires. Les premières études
portant sur ces auto-anticorps et utilisant des tech-
niques d'immunofluorescence, ont révélé quelques
spécificités des protéines nucléaires (1). La corrélation
entre la positivité des tests ANA et le lupus érythéma-
teux disséminé (LED) étant très élevée, un test ANA
négatif exclut, de fait, cette maladie (2).
Bien que la présence d'anticorps anti-ADN con-
stitue toujours une forte présomption de LED (3), un
certain nombre de macromolécules nucléaires (4) et
cytoplasmiques (5-7) ont également été détectées
et associées à d'autres collagénoses (8-10). Certains
de ces anticorps ont une valeur diagnostique et/ou
pronostique, notamment en cas de sclérodermie
généralisée évolutive (11-12), de connectivité mixte
(13-15), de syndrome de Sjögren (16-17), de polymyo-
site (18) et/ou de polyarthrite rhumatoïde (19). En raison
des associations cliniques, les tests ANA sont mainten-
ant reconnus comme un outil d'analyse général de la
collagénose (20).
La sensibilité des tests ANA varie en fonction du type
de substrat utilisé, de la méthode de fixation et du type
d'ANA présent dans le sérum. Les milieux de culture cel-
lulaire sont généralement plus sensibles que les coupes
de tissu (21-24). Le système de test ANA Colorzyme®
d'Immuno Concepts, qui utilise des cellules épithélioïdes
humaines présentant de nombreuses figures mitotiques*
(HEp-2), est l'un des systèmes de pointe pour la détec-
tion des ANA. Les cellules HEp-2 avec figures mitotiques
ont montré une sensibilité plus élevée et une identifica-
tion plus précise des divers motifs observables que le
substrat de rein de souris classique pour la détection
des anticorps dans la sclérodermie généralisée (25). Les
figures mitotiques aident à la différenciation des motifs
mais permettent également la détection d'antigènes
nucléaires non signalés précédemment et présents à
des concentrations plus élevées dans des cellules en
phase active de mitose (26-28).
* Mitose est un terme utilisé pour décrire le processus
de division cellulaire. Elle comprend généralement six
phases: interphase, prophase, métaphase, anaphase,
télophase et cytocinèse.
PRINCIPE DU TEST
Le système de test ANA Colorzyme® d'Immuno
Concepts utilise la technique immuno-enzymatique in-
directe. Les échantillons des patients sont mis à incuber
avec le substrat antigénique afin de permettre la liaison
spécifique des auto-anticorps aux noyaux cellulaires.
En présence d'ANA, un complexe antigène-anticorps
stable se forme. Après le rinçage destiné à éliminer les
anticorps non liés spécifiquement, le substrat est mis
à incuber avec un réactif anticorps anti-humain con-
jugué à de la peroxydase de raifort. Lorsque les résultats
sont positifs, on observe la formation d'un complexe
tripartite stable composé d'un anticorps enzymatique
lié à un anticorps anti-nucléaire humain, lui-même lié à
un antigène nucléaire. Pour visualiser ce complexe, il
faut mettre la lame à incuber dans un réactif coloré qui
contient un substrat spécifique à l'enzyme. La réaction
entre l'anticorps marqué par une enzyme et le substrat
spécifique à l'enzyme se traduit par une réaction
colorée sur la lame, visible par microscope optique
classique. Dans les échantillons positifs, les noyaux des
cellules présenteront une coloration bleu violet sombre
et une répartition particulière des antigènes nucléaires
dans les cellules. Si l'échantillon est négatif pour l'ANA,
le noyau ne présentera pas de répartition nucléaire
claire. La coloration du cytoplasme peut être faible
tandis que celle des régions non chromosomiques des
cellules mitotiques peut être plus sombre.
COMPOSITION DES SYSTEMES
Utilisation: Tous les composants sont prêts à l'emploi
et ne requièrent ni aliquotage ni reconstitution (sauf
pour le tampon PBS et le réactif coloré, qui doivent
être dissous dans une eau désionisée ou distillée avant
(MATÉRIELS FOURNIS)
utilisation).
Conservation: Tous les composants doivent être
conservés au réfrigérateur entre 2 et 10 °C. Après
reconstitution, le réactif tampon PBS doit être conservé
dans un récipient fermé, au réfrigérateur entre 2 et 10
°C. Après reconstitution, le réactif coloré Colorzyme®
doit être conservé dans un récipient fermé à tempéra-
ture ambiante, pendant 30 jours maximum. En fonction
de la fréquence d'utilisation, 150 ml de réactif coloré
Colorzyme® peuvent être utilisés avec vingt lames
maximum.
Stabilité: Tous les composants sont stables pendant 12
mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
RÉACTIFS
Lames de substrat: †Réf. catalogue 2007 (sept puits)
; 2013 (treize puits). Lames de substrat ANA à sept ou
treize puits utilisant des cellules HEp-2 (avec figures
mitotiques) dont la culture et la stabilisation sont
directement effectuées sur les puits de test. Le concept
unique de lame recouverte de téflon (Moat(tm)) évite
toute contamination croisée entre les puits pendant le
test. Les lames comprennent également des puits de
contrôle supplémentaires (positif, négatif et PBS) pour
faciliter l'interprétation des résultats. Le sachet de la
lame contient un gaz inerte non toxique qui contribue
à la stabilité des cellules. Si le sachet ne semble pas
gonflé lorsque la lame est sortie du kit, il a sans doute
été endommagé et la lame ne doit pas être utilisée.
Contrôle positif homogène: Réf. catalogue 2021. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires ADN et/ou DNP.
On observe une coloration homogène du sérum sur le
substrat de cellules HEp-2 d'Immuno Concepts, que l'on
retrouve dans la région chromosomique des cellules
mitotiques. Ce réactif contient 0,1 % d'azide de sodium
(conservateur).
Contrôle positif moucheté: Réf. catalogue 2022. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires Sm et/ou RNP. Ce
sérum présente l'une des fluorescences mouchetées
les plus courantes observées sur le substrat de cellules
Hep-2 d'Immuno Concepts. On note une fluorescence
négative dans la région chromosomique des cellules
mitotiques. Ce réactif contient 0,1 % d'azide de sodium
(conservateur).
Contrôle positif nucléolaire: Réf. catalogue 2023. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléolaires. Ce sérum
présente une fluorescence nucléolaire sur le substrat de
cellules HEp-2 d'Immuno Concepts. Ce réactif contient
0,1 % d'azide de sodium (conservateur).
Contrôle positif centromérique: Réf. catalogue 2025.
Flacon compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5
ml de sérum de contrôle humain positif riche en anti-
corps spécifiques aux centromères chromosomiques
(kinétochore). Ce sérum présente une fluorescence
mouchetée discrète sur le substrat de cellules HEp-2
d'Immuno Concepts, que l'on retrouve dans la région
chromosomique des cellules mitotiques. Ce réactif
contient 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).
Sérum de contrôle titrable: Réf. catalogue 2026. Flacon
prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de sérum de contrôle
humain positif, qui doit être traité comme un échantil-
lon de patient non dilué. Ce réactif contient 0,1 %
d'azide de sodium (conservateur). Voir l'étiquette du
flacon pour connaître le titre.
Sérum de contrôle négatif: Réf. catalogue 2031. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain négatif. Bien que le sérum
de contrôle négatif puisse présenter une faible fluores-
cence du cytoplasme et une fluorescence plus vive de
la région non chromosomique de la cellule mitotique,
on n'observe aucune fluorescence nucléaire. Ce réac-
tif contient 0,1 % d'azide de sodium (conservateur).
Réactif immuno-enzymatique: Réf. catalogue 4009
(9,0 ml), 4075 (23 ml). Globuline de chèvre anti-IgG
humaine (chaînes lourdes et légères) couplée à de la
peroxydase de raifort (HRP). Les kits de test complets
comprennent des flacons compte-gouttes de précision
prêts à l'emploi. Chaque flacon contient 9,0 ml de
réactif, soit la quantité suffisante pour 10 lames.
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