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PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE
PREPARACIÓN DEL TAMPÓN (PBS)
1.
Disuelva el contenido de una bolsa de tampón
PBS en un litro de agua desionizada o destilada.
El tampón PBS se puede tapar y conservar entre 2
y 10 ºC durante cuatro semanas como máximo.
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE COLOR
2.
Disuelva el contenido de una bolsa en 150 ml de
agua desionizada o destilada. Mezcle bien hasta
que se disuelva por completo. Este reactivo de
color es estable durante 30 días a temperatura
ambiente en un envase cerrado. Puede ser
reutilizado durante 30 días como máximo, o hasta
que se aprecie un cambio de color o alguna
precipitación. Es normal que al volverlo a utilizar
presente turbidez u opalescencia, sin precipitado
visible. Dependiendo de la frecuencia de uso,
se pueden utilizar 150 ml de reactivo de color
Colorzyme® con un máximo de 20 portaobjetos.
3. DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE PACIENTE
Selección: Disuelva las muestras de paciente a
01:40:00 añadiendo 0,05 ml (50 µl) de suero a 1,95
ml de PBS reconstituido.
Titulación semicuantitativa: Prepare series de
diluciones de la muestra o muestras de selección
(p. ej. 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) utilizando PBS.
4. PREPARACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS CON SUS-
TRATO (20-25 µl/pocillo)
Saque los portaobjetos de las bolsas y disponga
los sueros de control en los pocillos de control,
como se indica: Invierta el frasco cuentagotas
de control y apriete hasta que se vea una gota
en la punta. Toque suavemente el pocillo de
control con la gota, evitando que la punta del
cuentagotas entre en contacto directo con la
superficie del portaobjetos. Ponga el control
positivo en el pocillo marcado "+", el negativo
en el marcado "-" y una gota de tampón PBS
en el pocillo marcado "PBS". Añada una gota
(20-25 µl) de muestra de paciente a los pocillos
numerados.
NOTA: Para la selección general se recomienda
el control positivo homogéneo. Para la titulación
semicuantitativa, elija el control positivo cuyo
patrón de fluorescencia sea más parecido al
de la muestra de selección (p.ej., para una
muestra de paciente que presente un patrón de
fluorescencia moteado en la selección, utilice un
control positivo moteado).
PRECAUCIÓN: SI LA PUNTA DEL CUENTAGOTAS
TOCA DIRECTAMENTE LA SUPERFICIE DEL POR-
TAOBJETOS, SE PUEDE DAÑAR EL SUSTRATO DE
ANTÍGENO.
INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5 minu-
5.
tos a temperatura ambiente, es decir, entre 18
y 24 °C) Ponga los portaobjetos en una cámara
cubierta y húmeda (bastará con una placa de
Petri con una toalla de papel humedecida).
Incube con la tapa puesta durante 30 minutos
(±5 minutos) a temperatura ambiente (18-24 ºC).
ENJUAGUE CON PBS
6.
Saque los portaobjetos de la bandeja de la
incubadora y aclárelos brevemente con PBS
utilizando una jeringa o una pipeta de Pasteur
o serológica. No utilice la jeringa directamente
sobre los pocillos.
NOTA: Para evitar la contaminación cruzada de
los portaobjetos, dirija el chorro de PBS a la línea
media del portaobjetos, inclinando primero la fila
superior de pocillos y luego la inferior.
LAVADO CON PBS (10 minutos)
7.
Lave los portaobjetos con PBS durante 10
minutos, en una placa de tinción de portaobje-
tos o en una jarra Coplin. Se recomienda agitar
suavemente al sumergir el portaobjetos, cuando
haya pasado la mitad del tiempo y al sacarlo.
Este lavado puede durar de 10 a 30 minutos sin
que varíen los resultados finales. Una vez utilizada,
tire la solución de lavado PBS. Para que los resul-
tados sean óptimos cambie el PBS cuando haya
pasado la mitad del tiempo, y utilice un agitador
magnético.
8. REACTIVO ENZIMÁTICO PARA DETECTAR ANTICU-
ERPOS (cubra los pocillos con 12-14 gotas)
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno y
sumérjalos de 3 a 5 veces en agua desionizada o
ANA POR COLORZYME®
destilada. Pase un papel secante o una toalla de
papel por el borde del portaobjetos para retirar
el agua sobrante. Vuelva a colocar de inmediato
el portaobjetos en la cámara de incubación y
cubra los pocillos por completo con el reactivo
enzimático para detectar anticuerpos; empiece
por poner una gota en cada pocillo. Repita la
operación en cada portaobjetos. El reactivo
enzimático para detectar anticuerpos ha sido
titulado para compensar el agua desionizada o
destilada residual que queda en el portaobjetos
tras el enjuague.
NOTA: Es importante que los pocillos del portao-
bjetos no se sequen durante este procedimiento,
pues se podría dañar el sustrato.
NO MANCHE NI PERMITA QUE SE SEQUE EL
PORTAOBJETOS, NI DEJE QUE PASEN MÁS DE 15
SEGUNDOS SIN AÑADIR EL REACTIVO.
9. INCUBACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS (30±5 minu-
tos a temperatura ambiente, es decir, entre 18 y
24 °C)
Ponga los portaobjetos en un cámara de
incubación y deje que se incuben 30 minutos (±5
minutos) a temperatura ambiente (18-24 ºC).
10. ENJUAGUE CON PBS
Retire los portaobjetos de la bandeja de la
incubadora y enjuáguelos brevemente con PBS.
No utilice la jeringa directamente sobre los pocil-
los.
11. LAVADO CON PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante 10
minutos, en una placa de tinción de portaobje-
tos o en una jarra Coplin. Se recomienda agitar
suavemente al sumergir el portaobjetos, cuando
haya pasado la mitad del tiempo y al sacarlo.
Este lavado puede durar de 10 a 30 minutos sin
que varíen los resultados finales.
12. INCUBACIÓN DEL REACTIVO DE COLOR (30 minu-
tos a temperatura ambiente, es decir, entre 18 y
24 °C) Saque los portaobjetos del PBS de uno en
uno, sumérjalos de 3 a 5 veces en agua desion-
izada o destilada y golpéelos suavemente por
un lado con un papel secante o con toallas de
papel, para retirar el exceso de agua. Coloque
los portaobjetos inmediatamente en una jarra
Coplin con reactivo de color activado, y deje
incubar durante 30 minutos.
13. ENJUAGUE CON PBS
Saque los portaobjetos de uno en uno de la jarra
Coplin y enjuague con PBS por los dos lados
durante 4 ó 5 segundos. No utilice la jeringa
directamente sobre los pocillos. Ponga cada por-
taobjetos enjuagado con PBS en una jarra Coplin
llena de agua destilada o desionizada, hasta que
el reactivo de color desaparezca de todos los
portaobjetos. Pase inmediatamente al paso 14.
PREPARACIÓN DE LOS CUBREOBJETOS
14.
Saque los portaobjetos de uno en uno del agua
desionizada o destilada y golpéelos suavemente
por un lado con un papel secante o con toallas
de papel, para retirar el exceso de agua.
NO SEQUE EL PORTAOBJETOS NI DEJE QUE PASEN
MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN PONER EL CUBREOBJE-
TOS. Añada 4 ó 5 gotas de medio de prepara-
ción semipermanente en la línea media de cada
portaobjetos. Coloque el cubreobjetos con
cuidado, evitando que se formen bolsas de aire,
haciendo bajar suavemente el cubreobjetos de
un lado del portaobjetos al otro.
NOTA: Si pone demasiado medio de preparación
en el portaobjetos, puede que la resolución
de las células no sea clara (imagen borrosa). Si
ha puesto demasiado medio de preparación,
puede retirarlo del portaobjetos secando suave-
mente el cubreobjetos con papel secante o para
lentes, evitando cualquier movimiento directo
del cubreobjetos. Los portaobjetos se pueden
interpretar de inmediato, o conservarlos durante
algún tiempo entre 2 y 10 ºC sin que se pierda la
reactividad.
ASISTENCIA TÉCNICA: 916-363-2649
o correo electrónico:
techservice@immunoconcepts.com
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