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INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
I controlli positivo, negativo e PBS devono essere
analizzati nei pozzetti previsti per il controllo qualità su
ciascun vetrino. Il controllo positivo dovrebbe mostrare
una colorazione luminosa blu scuro-viola nei nuclei
delle cellule, con un pattern chiaramente distinguibile,
caratteristico del siero di controllo usato. Nel pozzetto
di controllo positivo il citoplasma può colorarsi di blu
chiaro-viola. Il controllo negativo dovrebbe mostrare
una colorazione blu chiaro-viola sia del citoplasma che
del nucleo, ma senza alcun pattern chiaramente distin-
guibile della colorazione nucleare. Il controllo PBS si usa
per osservare la colorazione non specifica del reagente
anticorpo enzimatico, e non dovrebbe mostrare alcuna
colorazione blu. Se i controlli non appaiono come
descritto, il test non è valido e deve essere ripetuto.
CONTROLLO TITOLABILE OPZIONALE
Nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leggere dal
pozzetto contenente il campione più diluito e leggono
"all'indietro" fino alla diluizione 1:40. Il primo pozzetto
in cui è visibile un pattern di colorazione nucleare
chiaramente distinguibile è il punto di equivalenza della
reazione. Raccomandiamo questa tecnica per deter-
minare i punti di equivalenza della reazione.
Il titolo medio e la gamma del titolo (± una diluizione
su ciascun lato della media) determinati sono stati
stabiliti nel nostro laboratorio e sono indicati come
guida. Questo controllo è fornito per consentire a
ciascun laboratorio di valutare la riproducibilità (di
precisione) del proprio test ANA. Dal momento che
questo controllo non è destinato ad essere un indica-
tore dell'accuratezza del titolo, ciascun laboratorio
deve stabilire il proprio punto medio di equivalenza
della reazione per questo campione e deve usare tali
informazioni per valutare la riproducibilità interfase (di
precisione).
Attraverso analisi multiple di questo controllo titolabile,
usando il sistema di analisi degli ANA Colorzyme® della
Immuno Concepts, è stato stabilito un valore medio
del titolo per ciascun numero di lotto. Il numero di lotto,
il titolo medio e la gamma del titolo (± una duplice
diluizione su ciascun lato della media) sono indicati
sull'etichetta della fiala e vanno usati come guida della
performance del sistema di analisi.
È importante che l'intensità della colorazione non
venga confusa con la presenza o l'assenza di anticorpi
antinucleari. Il fattore chiave da considerare nel
determinare se una data diluizione del siero è positiva
è l'aspetto del pattern chiaramente distinguibile, senza
tener conto dell'intensità della colorazione.
Questo controllo titolabile mostrerà il tipico pattern a
chiazze associato all'anticorpo RNP. Può essere presen-
te, però, anche un secondo pattern di NSp I (parecchie
chiazze discrete nel nucleo delle cellule interfase), che
comunque è il tipico pattern a chiazze RNP da usare
per leggere il punto di equivalenza della reazione.
I valori ottenuti nel nostro laboratorio possono essere
diversi dai vostri. Di seguito sono indicati alcuni tra i fat-
tori che possono influenzare i risultati.
1. Il giusto allineamento del percorso ottico del
microscopio. Per istruzioni, consultare il manuale del
proprio microscopio.
2. L'apertura numerica dell'obiettivo. L'apertura
numerica è correlata alla capacità di captazione
della luce ed alla risoluzione dell'obiettivo. Questo
numero è stampato sul lato dell'obiettivo.
3. La precisione e l'accuratezza della tecnica di dilu-
izione, dell'apparecchiatura e della performance
delle procedure di analisi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DEL PAZIENTE
Per screening positivo/negativo si raccomanda un
ingrandimento di 200X totali, mentre per il riconosci-
mento del pattern e per visualizzare le cellule mitotiche
si raccomanda un ingrandimento di 400X totali.
Negativo: un siero si considera negativo per gli anticorpi
antinucleari se la colorazione nucleare è minore o
uguale al pozzetto di controllo negativo con nessun
pattern chiaramente distinguibile. Il citoplasma può
mostrare una debole colorazione con colorazione più
brillante della regione non cromosomica delle cellule
mitotiche, ma senza alcun pattern nucleare chiara-
mente distinguibile.
Positivo: un siero si considera positivo se il nucleo mostra
un pattern di colorazione chiaramente distinguibile
nella maggior parte delle cellule interfase.
Titoli: nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leg-
gere dal pozzetto contenente il campione più diluito
e leggono "all'indietro" fino alla diluizione 1:40. Il primo
pozzetto in cui è visibile un pattern chiaramente distin-
guibile è il punto di equivalenza della reazione. Rac-
comandiamo questa tecnica per determinare i punti di
equivalenza della reazione. È importante che l'intensità
della colorazione non venga confusa con la presenza
o l'assenza di anticorpi antinucleari. Il fattore chiave
da considerare nel determinare se una data diluizione
del siero è positiva è l'aspetto del pattern chiaramente
distinguibile, indipendentemente dall'intensità della
colorazione.
Attenzione: alcuni sieri possono mostrare una colora-
zione nucleare e citoplasmatica senza alcun pattern
nucleare apparente. Questo fenomeno in genere è
dovuto agli anticorpi eterofili e deve essere riportato
come negativo.(31)
COLORAZIONE ENZIMATICA
Il grado di colorazione non ha valore clinico dimostrato
e il suo valore si limita ad essere indicatore del titolo.(29)
Per semplificare l'interpretazione, registrare i risultati
dello screening come fortemente positivi o positivi, e
titolare di conseguenza.
Reazione fortemente positiva: colorazione blu-viola
da scura a molto scura, profilo cellulare netto, pattern
nucleare ben definito.
Reazione Positiva: colorazione blu sbiadita o smorzata
con maggiore variabilità di colorazione tra le cellule;
il profilo cellulare può essere meno definito in alcune
cellule con una maggioranza di cellule che ancora
mostrano un pattern della colorazione chiaramente
distinguibile.
NOTA: poiché le cellule sono coltivate direttamente
sulla superficie del vetrino, non tutte sono nella stessa
fase del ciclo cellulare. Non è insolito vedere diverse
intensità di colorazione tra le cellule dovute alle dif-
ferenze nella concentrazione e nella posizione di diversi
antigeni durante il ciclo cellulare.
RIPORTO DEI RISULTATI
Screening: i risultati vanno riportati come fortemente
positivi o positivi alla diluizione 1:40 e va riportato il pat-
tern della colorazione nucleare.
Titoli: i risultati vanno riportati come ultima diluizione del
siero in cui si vede una colorazione chiaramente distin-
guibile. I risultati con una forte reazione alla diluizione
di 1:2560 vanno riportati come maggiori di 1:2560. Titoli
da 1:40 a 1:80 sono considerati bassi; da 1:160 a 1:
320 sono considerati medi e da 1:640 e maggiori sono
considerati alti.
RILEVAMENTO DEL PATTERN
Omogeneo: una colorazione del nucleo uniforme, con
o senza mascheramento apparente dei nucleoli. La
regione cromosomica delle cellule mitotiche metafase
è chiaramente positiva con una intensità di colorazione
liscia o periferica maggiore o uguale ai nuclei interfase.
Sinonimi: diffuso; uniforme.
Antigeni nucleari: dsDNA; nDNA; DNP; istone.
Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono
SLE (Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritema-
toso sistemico). Titoli bassi suggeriscono SLE o altre
patologie del tessuto connettivo.(32)
Periferico: una colorazione uniforme, principalmente
intorno alle regione esterna del nucleo con colorazione
più debole verso il centro del nucleo. La regione cro-
mosomica delle cellule mitotiche metafase è chiara-
mente positiva con una intensità di colorazione liscia o
periferica maggiore o uguale ai nuclei interfase.
Sinonimi: bordato, scabro, membranoso.
Antigeni nucleari: dsDNA, ssDNA, nDNA; DNP; istone.
Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono
SLE; titoli bassi suggeriscono SLE o altre patologie
del tessuto connettivo.(32)
A chiazze: una colorazione grossolana o finemente
granulare del nucleo in genere senza colorazione dei
nucleoli. La regione non cromosomica delle cellule mi-
totiche metafase mostra colorazione, mentre la regione
cromosomica è negativa alla colorazione.
Antigeni nucleari: Sm; RNP; Scl-70; SS-A; SS-B; e altri
sistemi antigene/anticorpo non ancora carat-
terizzati.
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