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SYStÈmE DE tESt ana FluorEScEnt
Pour utIlISatIon DIagnoStIQuE
UTILISATION PRÉVUE: Il s'agit d'un test
d'immunofluorescence indirecte pour la détection
semi-quantitative des anticorps anti-nucléaires dans
le sérum humain. Ce système de test doit être utilisé
comme une aide à la détection des anticorps associés
aux maladies rhumatismales systémiques.
rÉSumÉ Et EXPlIcatIon Du tESt
Anticorps anti-nucléaire (ANA) est un terme général
utilisé pour décrire les auto-anticorps dirigés contre
diverses protéines nucléaires. Les premières études
portant sur ces auto-anticorps, à l'aide de techniques
d'immunofluorescence, ont révélé quelques spécificités
des protéines nucléaires (1). La corrélation entre la
positivité des tests ANA et le lupus érythémateux dis-
séminé (LED) étant très élevée, un test ANA négatif
exclut, de fait, cette maladie (2).
Bien que la présence d'anticorps anti-ADN con-
stitue toujours une forte présomption de LED (3), un
certain nombre de macromolécules nucléaires (4) et
cytoplasmiques (5-7) ont également été détectées
et associées à d'autres collagénoses (8-10). Certains
de ces anticorps ont une valeur diagnostique et/ou
pronostique, notamment en cas de sclérodermie
généralisée évolutive (11-12), de connectivité mixte (13-
15), de syndrome de Sjögren (16-17), de polymyosite
(18) et/ou de polyarthrite rhumatoïde (19). En raison de
ces associations cliniques, les tests ANA sont mainten-
ant reconnus comme un outil d'analyse général de la
collagénose (20).
La sensibilité des tests ANA varie en fonction du type
de substrat utilisé, de la méthode de fixation et du type
d'ANA présent dans le sérum. Les milieux de culture cel-
lulaire sont généralement plus sensibles que les coupes
de tissu (21-24). Le système de test ANA d'Immuno
Concepts, qui utilise des cellules épithélioïdes humaines
présentant de nombreuses figures mitotiques* (HEp-2),
est un système d'immunofluorescence de pointe pour
la détection des ANA. Les cellules HEp-2 avec figures
mitotiques ont montré une sensibilité plus élevée et une
identification plus précise des divers motifs observables
que le substrat de rein de souris classique pour la détec-
tion des anticorps dans la sclérodermie généralisée
(25). Les figures mitotiques aident à la différenciation
des motifs mais permettent également la détection
d'antigènes nucléaires non signalés précédemment et
présents à des concentrations plus élevées dans des
cellules en phase active de mitose (26-28).
* Mitose est un terme utilisé pour décrire le processus
de division cellulaire. Elle comprend généralement six
phases: interphase, prophase, métaphase, anaphase,
télophase et cytocinèse.
PrIncIPE Du tESt
Le système de test ANA fluorescent d'Immuno
Concepts utilise la technique d'immunofluorescence
indirecte initialement décrite par Weller et Coons (29).
Les échantillons des patients sont mis à incuber avec
le substrat antigénique afin de permettre la liaison
spécifique des auto-anticorps aux noyaux cellulaires.
En présence d'ANA, un complexe antigène-anticorps
stable se forme. Après le rinçage destiné à éliminer
les anticorps non liés spécifiquement, le substrat est
mis à incuber avec un réactif d'anticorps anti-humain
conjugué à de la fluorescéine. Lorsque les résultats
sont positifs, on observe la formation d'un complexe
tripartite stable composé d'un anticorps fluorescent lié
à un anticorps anti-nucléaire humain, lui-même lié à un
antigène nucléaire. Ce complexe peut être visualisé
à l'aide d'un microscope à fluorescence. Dans les
échantillons positifs, les noyaux des cellules présen-
teront une fluorescence vert pomme et une répartition
particulière des antigènes nucléaires dans les cellules. Si
l'échantillon est négatif pour l'ANA, le noyau ne présen-
tera pas de répartition nucléaire claire.
comPoSItIon DES SYStÈmES
utilisation: Tous les composants sont prêts à l'emploi
et ne requièrent ni aliquotage ni reconstitution (sauf
pour le tampon PBS qui doit être dissous dans une eau
désionisée ou distillée avant utilisation).
conservation: Tous les composants doivent être
conservés au réfrigérateur entre 2 et 10 °C. Après
reconstitution, le tampon PBS doit être conservé dans
des récipients à bouchon à vis, au réfrigérateur entre
2 et 10 °C.
in vitro
(matÉrIElS FournIS)
Stabilité: Tous les composants sont stables pendant 12
mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
rÉactIFS
lames de substrat: †Réf. catalogue 2007 (sept puits)
; 2013 (treize puits). Lames de substrat ANA à sept ou
treize puits utilisant des cellules HEp-2 (avec figures
mitotiques) dont la culture et la stabilisation sont
directement effectuées sur les puits de test. Le concept
unique de lame recouverte de téflon (Moat™) évite
toute contamination croisée entre les puits pendant le
test. Les lames comprennent également des puits de
contrôle supplémentaires (positif, négatif et PBS) pour
faciliter l'interprétation des résultats. Le sachet de la
lame contient un gaz inerte non toxique qui contribue
à la stabilité des cellules. Si le sachet ne semble pas
gonflé lorsque la lame est sortie du kit, il a sans doute
été endommagé et la lame ne doit pas être utilisée.
contrôle positif homogène: Réf. catalogue 2021. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires ADN et/ou DNP.
On observe une coloration homogène du sérum sur le
substrat de cellules HEp-2 d'Immuno Concepts, que l'on
retrouve dans la région chromosomique des cellules
mitotiques.
contrôle positif moucheté: Réf. catalogue 2022. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléaires Sm et/ou RNP. Ce
sérum présente l'une des fluorescences mouchetées
les plus courantes observées sur le substrat de cellules
Hep-2 d'IC. On note une fluorescence négative dans la
région chromosomique des cellules mitotiques.
contrôle positif nucléolaire: Réf. catalogue 2023. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5 ml de
sérum de contrôle humain positif riche en anticorps
spécifiques aux antigènes nucléolaires. Ce sérum
présente une fluorescence nucléolaire sur le substrat de
cellules HEp-2 d'IC.
contrôle positif centromérique: Réf. catalogue 2025.
Flacon compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 0,5
ml de sérum de contrôle humain positif riche en anti-
corps spécifiques aux centromères chromosomiques
(kinétochore). Ce sérum présente une fluorescence
mouchetée discrète sur le substrat de cellules HEp-2
d'IC, que l'on retrouve dans la région chromosomique
des cellules mitotiques.
Sérum de contrôle titrable: Réf. catalogue 2026. Flacon
prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de sérum de contrôle
humain positif, qui doit être traité comme un échantil-
lon patient pur (non dilué). Voir l'étiquette du flacon
pour connaître le titre.
Sérum de contrôle négatif: Réf. catalogue 2031. Flacon
compte-gouttes prêt à l'emploi contenant 1,0 ml de
sérum de contrôle humain négatif. Bien que le sérum
de contrôle négatif puisse présenter une faible fluores-
cence du cytoplasme et une fluorescence plus vive de
la région non chromosomique de la cellule mitotique,
on n'observe aucune fluorescence nucléaire.
Réactif immunofluorescent: Réf. catalogue 2009
(9,0 ml), 2075 (23 ml). Globuline de chèvre anti-IgG
humaine (chaînes lourdes et légères) conjuguée à de
l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les kits de test
complets comprennent des flacons compte-gouttes de
précision prêts à l'emploi. Chaque flacon contient 9,0
ml de réactif, soit la quantité suffisante pour 10 lames.
† Cette lame est protégée par un ou plusieurs des
brevets suivants déposés aux États-Unis et à l'étranger:
4387972, D-274261, D-273261, brevet canadien 1171302
et autres brevets en attente.
rÉactIFS nÉgatIFS
Poudre tampon PBS: Réf. catalogue 1011. Solution saline
en poudre tamponnée au phosphate (0,01 M, pH 7,4
± 0,2). Chaque sachet contient une quantité suffisante
de poudre tampon pour préparer 1 litre de solution.
(Chaque kit de test complet contient un sachet de
poudre tampon pour cinq lames.)
Préparation: Dissoudre un sachet de poudre tampon
dans 1 litre d'eau désionisée ou distillée, couvrir puis
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