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FluorEScEnza DEglI ana
1.
rIcoStItuzIonE DEl tamPonE (PBS)
Sciogliere il contenuto di una busta di
tampone in un litro di acqua deionizzata o
distillata. Il tampone PBS può essere coperto
e conservato a 2-10°C fino a quattro set-
timane.
DIluIzIonE DEI camPIonI DEI PazIEntI
2.
Screening: diluire i campioni dei pazienti a
1:40 aggiungendo 0,05 ml (50 µl) di siero a
1,95 ml di PBS ricostituito.
Titolo semi-quantitativo: fare delle diluizioni
seriali del/i campione/i dello screening (ad
es. 1,80, 1,160, 1,320...1:2560) usando il PBS.
PrEParazIonE DEI VEtrInI DEl SuBStrato
.
(20-25 µl/pozzetto)
Rimuovere il/i vetrino/i dal contenitore/i e
porre i sieri di controllo sui pozzetti di controllo
come descritto di seguito. Capovolgere il
flacone contagocce di controllo e premere
delicatamente fino a che in punta è visibile
la goccia. Appoggiare delicatamente la
goccia sul pozzetto di controllo appropriato
evitando il contatto diretto della punta del
contagocce con la superficie del vetrino.
Mettere il controllo positivo sul pozzetto mar-
cato "+", il controllo negativo sul pozzetto
marcato "-", e una goccia di tampone PBS
sul pozzetto marcato "PBS". Aggiungere 1
goccia (20-25 µl) di campione del paziente
ai pozzetti numerati.
nota: per uno screening generale, si rac-
comanda il controllo positivo omogeneo.
Per titolazione semi-quantitativa scegliere
il controllo positivo che mostra il pattern di
fluorescenza più simile al campione dello
screening (ad es., per un campione del
paziente che nello screening dà un pattern
di fluorescenza a chiazze, usare il controllo
positivo punteggiato).
attEnzIonE: IL CONTATTO DIRETTO DELLA
PUNTA DEL CONTAGOCCE CON LA SUPER-
FICIE DEL VETRINO PUÒ DANNEGGIARE IL
SUBSTRATO ANTIGENE.
4.
IncuBazIonE DEI VEtrInI (30±5 minuti a
temperatura ambiente, cioè 18-24°C)
Mettere il/i vetrino/i in una camera umida,
coperta (una capsula di Petri con carta
assorbente inumidita andrà bene). Incubare,
col coperchio, per 30 minuti (±5 minuti) a
temperatura ambiente (18-24°C).
5.
rIScIacQuo con PBS
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto
dell'incubatore e sciacquare brevemente
con PBS usando una bottiglia a zampillo, una
pipetta di Pasteur o una pipetta sierologica.
Non far zampillare il tampone direttamente
sui pozzetti.
nota: per evitare la contaminazione incro-
ciata sui vetrini, orientare il flusso di PBS lungo
la linea mediana del vetrino, inclinandolo
prima verso la fila di pozzetti superiore e poi
verso quella inferiore.
6.
laVaggIo col PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in
un piatto per la colorazione del vetrino o una
vaschetta Coplin. Si raccomanda di agitare
con delicatezza all'immersione del vetrino, al
punto mediano e alla rimozione. Questo la-
vaggio può durare fino a 10-30 minuti senza
che i risultati finali dell'analisi varino. Eliminare
la soluzione di lavaggio PBS dopo l'uso. Per
risultati ottimali, cambiare il PBS al punto
mediano e usare un agitatore magnetico.
7.
rEagEntE antIcorPo FluorEScEntE
(coprire i pozzetti con 12-14 gocce)
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS e
immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata o
distillata. Tamponare il vetrino sul lato con
carta bibula o con carta assorbente in modo
da eliminare l'acqua in eccesso. Riportare
immediatamente il vetrino nella camera di
incubazione e coprire completamente i poz-
zetti usando il reagente anticorpo fluores-
cente; iniziare mettendo una goccia su ogni
pozzetto. Ripetere l'operazione per ciascun
ProcEDura DI analISI In
vetrino. Il reagente anticorpo fluores-
cente è stato titolato al fine di compensare
l'acqua deionizzata o distillata residua che
resta sul vetrino dopo il risciacquo.
nota: è importante che i pozzetti dei vetrini
non si asciughino durante questa proce-
dura onde evitare il danneggiamento del
substrato.
TAMPONARE O ASCIUGARE IL VETRINO IN
MANIERA CHE LO STESSO NON RESTI SENZA
REAGENTE ANTICORPO FLUORESCENTE PER
PIÙ DI 15 SECONDI.
IncuBazIonE DEI VEtrInI (30±5 minuti a
8.
temperatura ambiente, cioè 18-24°C)
Mettere il coperchio sulla camera di in-
cubazione e coprire con carta assorbente
per impedire l'esposizione alla luce se la
cella non è opaca. Lasciare incubare il/i
vetrino/i per 30 minuti (±5 minuti) a tem-
peratura ambiente (18-24°C).
9.
rIScIacQuo col PBS
Rimuovere il/i vetrino/i dal piatto
dell'incubatore e sciacquare brevemente
con PBS. Non far zampillare il tampone
direttamente sui pozzetti.
10. laVaggIo col PBS (10 minuti)
Lavare il/i vetrino/i per 10 minuti con PBS in
un piatto per la colorazione del vetrino o
una vaschetta Coplin. Si raccomanda di
agitare con delicatezza all'immersione del
vetrino, al punto mediano e alla rimozione.
Questo lavaggio può durare fino a 10-30
minuti senza che i risultati finali dell'analisi
cambino quando non si usa colorante di
contrasto.
Colorante di contrasto opzionale: ( numero
di catalogo 1105. Fiala contagocce pronta
per l'uso contenente 5,0 ml di soluzione blu
di Evans (0,5% in PBS))
Aggiungere 5-10 gocce di colorante
di contrasto per 100 ml di PBS prima di
immergere il vetrino. Poiché il grado di
colorazione di contrasto desiderato può
variare da un individuo all'altro, l'intensità
della colorazione di contrasto può essere
aumentata o diminuita semplicemente
regolando il numero di gocce aggiunte al
PBS in questo lavaggio.
11. montaggIo DEl VEtrIno coPrIoggEttI
Rimuovere uno alla volta i vetrini dal PBS e
immergerli 3-5 volte in acqua deionizzata
o distillata. Tamponare il vetrino sul lato
con carta bibula o con carta assorbente in
modo da eliminare l'acqua in eccesso.
TAMPONARE O ASCIUGARE IL VETRINO
IN MANIERA CHE NON RIMANGA SENZA
COPRIVETRINO PER PIÙ DI 15 SECONDI.
Aggiungere 4-5 gocce di mezzo di fissaggio
semipermanente lungo la linea mediana
di ciascun vetrino. Posizionare con at-
tenzione il vetrino coprioggetto, evitando
vuoti d'aria, abbassando delicatamente il
vetrino coprioggetto da un estremo all'altro
del vetrino.
nota: una quantità eccessiva di mezzo
di fissaggio sul vetrino può causare
un'alta fluorescenza di fondo, dovuta alla
dispersione della luce o alla mancanza di
risoluzione chiara delle cellule (immagine
sfocata). L'eccesso del mezzo di fissaggio
può essere eliminato dal vetrino tamponan-
do delicatamente il vetrino coprioggetto
con carta assorbente o carta per pulire
lenti evitando qualsiasi movimento diretto
del vetrino coprioggetto.
PER ASSISTENZA TECNICA: +1 916-363-2649
oppure a mezzo e-mail:
techservice@immunoconcepts.com
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