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ProcEDImIEnto DE análISIS DE ana
Por InmunoFluorEScEncIa
PrEParacIón DEl tamPón (PBS)
1.
Disuelva el contenido de una bolsa de
tampón en un litro de agua desionizada o
destilada. El tampón PBS se puede tapar y
conservar a 2-10 ºC durante cuatro semanas
como máximo.
DIlucIón DE laS muEStraS DE PacIEntES
2.
Selección: Disuelva las muestras de pacientes
a 1:40 añadiendo 0,05 ml (50 µl) de suero a
1,95 ml de PBS reconstituido.
Titulación semicuantitativa: Prepare series de
diluciones de la muestra o muestras de selec-
ción (p. ej. 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) utilizando
PBS.
.
PrEParacIón DE loS PortaoBJEtoS con
SuStrato (20-25 µl/pocillo)
Saque los portaobjetos de las bolsas y
disponga los sueros de control en los pocillos
de control, como se indica: Invierta el frasco
cuentagotas de control y apriete hasta
que se vea una gota en la punta. Toque
suavemente el pocillo de control con la gota,
evitando que la punta del cuentagotas entre
en contacto directo con la superficie del
portaobjetos. Ponga el control positivo en el
pocillo marcado con "+", el negativo en el
marcado con "-" y una gota de tampón PBS
en el pocillo marcado con "PBS". Añada una
gota (20-25 µl) de muestra de paciente a los
pocillos numerados.
nota: Para la selección general se reco-
mienda el control positivo homogéneo. Para
la titulación semicuantitativa elija el control
positivo cuyo patrón de fluorescencia sea más
parecido al de la muestra de selección (p. ej.,
para una muestra de paciente que presente
un patrón de fluorescencia moteado en la se-
lección, utilice un control positivo moteado).
PRECAUCIÓN: SI LA PUNTA DEL CUENTAGO-
TAS TOCA DIRECTAMENTE LA SUPERFICIE DEL
PORTAOBJETOS, SE PUEDE DAÑAR EL SUSTRATO
DE ANTÍGENO.
4.
IncuBacIón DE loS PortaoBJEtoS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir,
18-24 °C)
Ponga los portaobjetos en una cámara cu-
bierta y húmeda (bastará con una placa de
Petri con una toalla de papel humedecida).
Incube con la tapa puesta durante 30 minutos
(±5 minutos) a temperatura ambiente (18-24
ºC).
EnJuaguE con PBS
5.
Saque los portaobjetos de la bandeja de la
incubadora y aclárelos un poco con PBS utili-
zando una jeringa o una pipeta de Pasteur o
serológica. No utilice la jeringa directamente
sobre los pocillos.
nota: Para evitar la contaminación cruzada
de los portaobjetos, dirija el chorro de PBS a
la línea media del portaobjetos, inclinando
primero la fila superior de pocillos y luego la
superior.
6.
laVaDo con PBS (10 minutos)
Lave los portaobjetos con PBS durante 10
minutos, en una placa de tinción de portao-
bjetos o en una jarra Coplin. Se recomienda
agitar suavemente al sumergir el portaobjetos,
cuando haya pasado la mitad del tiempo
y al sacarlo. Este lavado puede durar 10-30
minutos sin que varíen los resultados finales.
Una vez utilizada, tire la solución de lavado
PBS. Para que los resultados sean óptimos
cambie el PBS cuando haya pasado la mitad
del tiempo, y utilice un agitador magnético.
7.
rEactIVo FluorEScEntE Para DEtEctar an-
tIcuErPoS (cubra los pocillos con 12-14 gotas)
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno
y sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o
destilada. Pase un papel secante o una toalla
de papel por el borde del portaobjetos para
retirar el agua sobrante. Vuelva a colocar de
inmediato el portaobjetos en la cámara de
incubación y cubra los pocillos por completo
con el reactivo fluorescente para detectar
anticuerpos; empiece por poner una gota en
cada pocillo. Repita la operación en cada
portaobjetos. El reactivo fluorescente para
detectar anticuerpos ha sido titulado para
compensar el agua desionizada o destilada
residual que queda en el portaobjetos tras el
enjuague.
nota: Es importante que los pocillos del
portaobjetos no se sequen durante este pro-
cedimiento, pues se podría dañar el sustrato.
NO SEQUE EL PORTAOBJETOS NI DEJE QUE
PASEN MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN AÑADIR EL
REACTIVO.
8.
IncuBacIón DE loS PortaoBJEtoS (30±5
minutos a temperatura ambiente, es decir,
18-24 °C)
Ponga la tapa de la cámara de incubación y
cúbrala con una toalla de papel para impedir
la exposición a la luz, si la cámara no es
opaca. Deje que los portaobjetos se incuben
30 minutos (±5 minutos) a temperatura ambi-
ente
(18-24 ºC).
9.
EnJuaguE con PBS
Retire los portaobjetos de la bandeja de la
incubadora y enjuáguelos un poco con PBS.
No utilice la jeringa directamente sobre los
pocillos.
laVaDo con PBS (10 minutos)
10.
Lave los portaobjetos con PBS durante 10
minutos, en una placa de tinción de portao-
bjetos o en una jarra Coplin. Se recomienda
agitar suavemente al sumergir el portaobjetos,
cuando haya pasado la mitad del tiempo
y al sacarlo. Este lavado puede durar 10-30
minutos sin que varíen los resultados finales,
cuando no se utiliza contratinción.
Contratinción opcional: (Nº de catálogo
1105. Vial con cuentagotas listo para usar,
que contiene 5,0 ml de solución de azul de
Evan (0,5 % en PBS))
Añada 5-10 gotas de contratinción por 100
ml de PBS antes de sumergir el portaobjetos.
Dado que el grado de contratinción deseado
puede variar de unos individuos a otros, se
puede aumentar o reducir la intensidad de
la contratinción simplemente ajustando el
número de gotas que se añaden al PBS en
este lavado.
PrEParacIón DE loS cuBrEoBJEtoS
11.
Saque los portaobjetos del PBS de uno en uno
y sumérjalos 3-5 veces en agua desionizada o
destilada. Pase un papel secante o una toalla
de papel por el borde del portaobjetos para
retirar el agua sobrante.
NO SEQUE EL PORTAOBJETOS NI DEJE QUE
PASEN MÁS DE 15 SEGUNDOS SIN PONER EL
CUBREOBJETOS. Añada 4-5 gotas de medio
de preparación semipermanente en la línea
media de cada portaobjetos. Coloque el
cubreobjetos con cuidado, evitando que
se formen bolsas de aire, haciendo bajar
suavemente el cubreobjetos de un lado del
portaobjetos al otro.
nota: Si pone demasiado medio de prepara-
ción puede que la fluorescencia de fondo sea
elevada debido a la diseminación de la luz, o
que la resolución de las células no sea clara
(imagen borrosa). Si ha puesto demasiado
medio de preparación, puede retirarlo del
portaobjetos secando suavemente el cu-
breobjetos con papel secante o para lentes,
evitando cualquier movimiento directo del
cubreobjetos.
ASISTENCIA TÉCNICA: 916-363-2649
o correo electrónico:
techservice@immunoconcepts.com
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