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ana FluorESzEnz-tEStVErFaHrEn
PuFFEr (PBS) rEkonStItuIErEn
1.
Inhalt eines Beutels mit PBS-Pufferpulver in
einem Liter deionisiertem oder destilliertem
Wasser auflösen. Die PBS-Waschpufferlösung
kann verschlossen und gekühlt bei 2-10 °C bis
zu vier Wochen aufbewahrt werden.
2.
PatIEntEnProBEn VErDÜnnEn
Screening: Patientenproben 1:40 verdünnen,
indem 0,05 ml (50 µl) Serum zu 1,95 ml rekonsti-
tuiertem PBS zugegeben werden.
Semiquantitative Titrierung: Für die weitere
Titrierung Reihenverdünnungen der Serum-
probe (z. B. 1:80, 1:160, 1:320...1:2560) unter
Verwendung von PBS herstellen.
.
SuBStratträgEr VorBErEItEn (20-25 µl/Verti-
efung)
Objektträger aus der Folie entnehmen und
Kontrollseren wie folgt in den Kontrollvertiefun-
gen platzieren: Tropfflasche mit Kontrollserum
umdrehen und vorsichtig drücken, bis an der
Spitze ein Tropfen austritt. Den Tropfen vorsi-
chtig in die entsprechende Kontrollvertiefung
geben, dabei direkten Kontakt der Tropfer-
spitze mit der Oberfläche des Objektträgers
vermeiden. Das positive Kontrollserum in die
mit "+" markierte Vertiefung, das negative
Kontrollserum in die mit "-" markierte Verti-
efung und einen Tropfen PBS-Puffer in die mit
"PBS" markierte Vertiefung geben. 1 Tropfen
(20-25 µl) Patientenprobe in die nummerierten
Vertiefungen geben.
HInWEIS: Für allgemeine Screening-Verfahren
wird die homogene Positivkontrolle emp-
fohlen. Für die semiquantitative Titrierung
wählen Sie die Positivkontrolle aus, deren
Fluoreszenz-Muster die meiste Ähnlichkeit mit
der Screening-Probe hat (z.B. ist für Patien-
tenproben, die beim Screening ein fleckiges
Fluoreszenz-Muster ergeben, eine gefleckte
Positivkontrolle zu verwenden).
acHtung: DIREKTER KONTAKT DER TROPFER-
SPITZE MIT DEM OBJEKTTRÄGER KANN DAS
ANTIGEN-SUBSTRAT BESCHÄDIGEN.
4.
oBJEktträgEr InkuBIErEn (30 ± 5 Minuten bei
Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Objektträger in eine feuchte, bedeckte Schale
legen (z. B. Petrischale mit angefeuchtetem
Papierhandtuch). 30 Minuten (± 5 Minuten)
bei Zimmertemperatur (18-24 °C) abgedeckt
inkubieren lassen.
5.
PBS-SPÜlung
Objektträger aus der Inkubationsschale
nehmen und mit Spritzflasche, Pasteur- oder
serologischer Pipette kurz mit PBS spülen. Den
Puffer nicht direkt in die Vertiefungen einsprit-
zen.
HINWEIS: Um bei Objektträgern eine Kreuz-
kontamination zu vermeiden, den PBS auf die
Mittellinie des Objektträgers spritzen, dabei
den Träger zuerst in Richtung der oberen
Vertiefungen neigen, anschließend in Richtung
der unteren Vertiefungen.
6.
PBS-WaScHVorgang (10 Minuten)
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß
10 Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder,
Schale). Beim Eintauchen, in der Mitte des
Waschvorgangs und beim Herausnehmen
leicht hin- und herbewegen. Der Wasch-
vorgang kann ohne Auswirkung auf die
Testergebnisse auf 10-30 Minuten ausgedehnt
werden. PBS-Waschlösung nach Gebrauch
entsorgen. Für optimale Ergebnisse sollte nach
Ablauf der halben Waschzeit der PBS-Was-
chpuffer gewechselt und ein magnetischer
Rührer verwendet werden.
7.
FluorESzEnz-antIkörPErrEagEnS (Vertiefun-
gen mit 12-14 Tropfen befüllen)
Jeweils einen Objektträger aus dem PBS-Puffer
nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes oder
destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges
Wasser durch Ausklopfen auf Saugpapier oder
Papierhandtuch entfernen. Objektträger sofort
wieder in die Inkubationskammer geben und
die Vertiefungen vollständig mit Fluoreszenz-
Antikörperreagens füllen; beginnend mit
einem Tropfen pro Vertiefung. Vorgang für alle
Objektträger wiederholen. Das Fluoreszenz-An-
tikörperreagens wurde titriert, um für auf dem
Objektträger verbliebenes deionisiertes oder
destilliertes Wasser zu kompensieren.
HInWEIS: Es ist wichtig, dass die Vertiefungen
auf dem Objektträger während dieses Vor-
gangs nicht austrocknen, andernfalls kann das
Substrat beschädigt werden.
DEN OBJEKTTRÄGER NICHT TROCKEN TUPFEN
ODER WISCHEN, ODER LÄNGER ALS 15 SEKUN-
DEN OHNE FLUORESZENZ-ANTIKÖRPERREAGENS
STEHEN LASSEN.
8.
oBJEktträgEr InkuBIErEn (30 ± 5 Minuten bei
Zimmertemperatur, 18-24 °C)
Deckel auf Inkubationskammer setzen und mit
Papierhandtuch abdecken, um das Eindrin-
gen von Licht zu vermeiden, falls die Kammer
durchsichtig ist. Objektträger 30 Minuten (±
5 Minuten) bei Zimmertemperatur (18-24 °C)
inkubieren lassen.
PBS-SPÜlung
9.
Objektträger aus der Inkubationsschale
nehmen und kurz mit PBS spülen. Den Puffer
nicht direkt in die Vertiefungen einspritzen.
PBS-WaScHVorgang (10 Minuten)
10.
Objektträger in einem entsprechenden Gefäß
10 Minuten mit PBS waschen (Glaszylinder,
Schale). Beim Eintauchen, in der Mitte des
Waschvorgangs und beim Herausnehmen
leicht hin- und herbewegen. Der Wasch-
vorgang kann ohne Auswirkung auf die
Testergebnisse auf 10-30 Minuten ausgedehnt
werden, wenn keine Gegenfärbung verwen-
det wird.
Optionale Gegenfärbung: (er Tropfer mit 5,0
ml Evans Blau-Lösung (0,5 % in PBS))
Vor dem Eintauchen des Objektträgers
5-10 Tropfen Gegenfärbung pro 100 ml PBS
hinzugeben. Da je nach Patient unterschiedli-
che Grade von Gegenfärbung gewünscht
sind, kann die Intensität der Gegenfärbung
durch die Anzahl der in diesem Waschgang
zum PBS hinzugegebenen Tropfen problemlos
erhöht oder verringert werden.
DEckglaS auFSEtzEn
11.
Jeweils einen Objektträger aus dem PBS-Puffer
nehmen und 3-5 Mal in deionisiertes oder
destilliertes Wasser tauchen. Überschüssiges
Wasser durch Ausklopfen auf Saugpapier oder
Papierhandtuch entfernen.
DEN OBJEKTTRÄGER NICHT TROCKEN TUPFEN
ODER WISCHEN, ODER LÄNGER ALS 15 SEKUN-
DEN OHNE DECKGLAS STEHEN LASSEN. 4-5
Tropfen semipermanentes Montagemedium
entlang der Mittellinie jedes Objektträgers
hinzugeben. Deckglas vorsichtig in Position
bringen; dabei Lufteinschlüsse vermeiden;
hierzu das Deckglas vorsichtig an einem Ende
des Objektträgers aufsetzen und auf das
andere Ende herablassen.
HInWEIS: Überschüssiges Montagemedium
auf dem Objektträger kann wegen der
Lichtstreuung oder wegen ungenügender
Auflösung der Zellen (verschwommenes Bild)
zu einem hohen Fluoreszenz-Hintergrund
führen. Überschüssiges Montagemedium kann
vom Objektträger entfernt werden, indem
das Deckglas mit Saugpapier abgetupft wird,
ohne es dabei zu bewegen.
TECHNISCHE UNTERSTÜTZUNG: +916-363-2649
oder via E-Mail:
techservice@immunoconcepts.com
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