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SIStEma DI analISI In FluorEScEnza DEglI ana
PEr uSo DIagnoStIco iN viTro
USO PREVISTO: analisi in fluorescenza indiretta degli
anticorpi per la determinazione semiquantitativa degli
anticorpi antinucleari nel siero umano. Questo sistema
di analisi deve essere usato come ausilio nella deter-
minazione di anticorpi associati alla malattia reumatica
sistemica.
rIEPIlogo E InFormazIonI DI BaSE
Anticorpo antinucleare (ANA) è un termine generico
usato per descrivere gli anticorpi contro varie nucleo-
proteine cellulari. I primi studi su questi anticorpi, con
l'uso di tecniche di immunofluorescenza, rivelarono
alcune specificità proteiche nucleari selezionate.(1)
A causa dell'alta correlazione dell'ANA positivo con il
lupus eritematoso sistemico (SLE), un ANA negativo fu
principalmente escluso dalla patologia.(2)
Sebbene anticorpi specifici del DNA continuino a
dimostrare un'elevata correlazione della patologia
con SLE,(3) è stato anche scoperto un certo numero di
macromolecole nucleari (4) e citoplasmatiche(5-7) as-
sociate ad altre patologie del tessuto connettivo.(8-10)
Alcuni di questi anticorpi sembrano avere un significato
diagnostico e/o prognostico nella sclerosi sistemica
progressiva,(11-12) nella malattia mista del connet-
tivo,(13-15) nella sindrome di Sjögren,(16-17) nella
polimiosite(18) e/o nell'artrite reumatoide.(19) A causa
delle associazioni tra queste patologie, il test ANA è
ora riconosciuto come uno strumento di screening
generale per le patologie del tessuto connettivo.(20)
La sensibilità dell'analisi ANA varia a seconda del tipo
di substrato usato, delle procedure di fissaggio e dei tipi
di ANA presenti nei sieri. I substrati della coltura cellulare
in genere mostrano una maggiore sensibilità rispetto
alle sezioni di tessuto.(21-24)
Il sistema di analisi ANA della Immuno Concepts con
cellule epitelioidi umane mitotiche* (HEp-2) rappre-
senta una tecnica avanzata di immunofluorescenza
per il rilevamento di ANA. È stato dimostrato che,
nel rilevamento di anticorpi nella sclerosi sistemica
progressiva (PSS),(25) le cellule HEp-2 con figure
mitotiche hanno una maggiore sensibilità e danno un
pattern di riconoscimento più nitido rispetto al classico
substrato di rene di topo. Le figure mitotiche aiutano
nel riconoscimento del pattern differenziale come pure
nel rilevamento di antigeni nucleari non riportati prec-
edentemente, presenti in concentrazioni più elevate
nelle cellule mitoticamente attive.(26-28)
*Mitosi è un termine usato per descrivere il processo di
suddivisione cellulare. Per lo più si suddivide in sei fasi,
ovvero interfase, profase, metafase, anafase, telofase
e citocinesi.
PrIncIPIo DEl tESt
Il sistema di analisi in fluorescenza degli ANA IC utilizza
il metodo dell'immunofluorescenza indiretta, descritto
per la prima volta da Weller e Coons.(29) I campioni
del paziente sono incubati con substrato antigene per
consentire lo specifico legame degli autoanticorpi ai
nuclei delle cellule. Se gli ANA sono presenti, si forma un
complesso stabile antigene-anticorpo. Dopo il lavaggio
per rimuovere anticorpi non specificamente legati, il
substrato viene incubato con un anticorpo anti-umano
coniugato con fluoresceina Quando i risultati sono
positivi, avviene la formazione di un complesso stabile
in tre parti composto dall'anticorpo fluorescente
legato all'anticorpo antinucleare umano che è legato
all'antigene nucleare. Tale complesso può essere visu-
alizzato con l'ausilio di un microscopio a fluorescenza.
Nei campioni positivi, i nuclei delle cellule mostre-
ranno una fluorescenza verde mela con un pattern di
colorazione caratteristico della particolare distribuzione
dell'antigene nucleare nelle cellule. Se il campione è
negativo all'ANA, il nucleo non mostrerà un pattern di
fluorescenza nucleare chiaramente distinguibile.
comPonEntI DEl SIStEma
uso: tutti i componenti sono pronti per l'uso senza che
siano necessarie la suddivisione in aliquote o la ricosti-
tuzione (tranne il tampone PBS che deve essere sciolto
in acqua deionizzata o distillata prima dell'uso).
conservazione: tutti i componenti possono essere
conservati alla temperatura di 2-10°C. Dopo la rico-
stituzione, il tampone PBS deve essere conservato in
contenitori con tappo a vite refrigerati alla temperatura
di 2-10°C.
(matErIalI FornItI)
Stabilità: tutti i componenti restano stabili per almeno 12
mesi dalla data di produzione. Non usare alcun compo-
nente oltre la data di scadenza.
rEagEntI rEattIVI
Vetrini del substrato: † numero di catalogo 2007 (con
sette pozzetti); 2013 (con tredici pozzetti). Vetrini per
substrato ANA con sette o tredici pozzetti che usano
cellule HEp-2 (con figure mitotiche) coltivate e stabiliz-
zate direttamente sui pozzetti per analisi. L'esclusivo
design a fossa del vetrino minimizza la contaminazione
incrociata dei pozzetti durante l'analisi. I vetrini com-
prendono anche ulteriori pozzetti di controllo positivo,
negativo e PBS per favorire l'esatta interpretazione dei
risultati. La busta del vetrino viene riempita con un gas
inerte non tossico che favorisce la stabilità delle cellule.
Se il contenitore non appare ben gonfio quando il
vetrino è rimosso dal kit, la busta è danneggiata e il
vetrino non deve essere usato.
controllo positivo omogeneo: numero di catalogo
2021. Fiala contagocce pronta all'uso contenente 1,0
ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per il DNA e/o antigeni nucleari DNP. Questo
siero dimostra una reazione a colorazione omogenea
sul substrato cellulare HEp-2 della IC. La regione cromo-
somica delle cellule mitotiche mostra la stessa reazione
alla colorazione omogenea.
controllo positivo a chiazze: numero di catalogo 2022.
Fiala contagocce pronta per l'uso contenente 0,5
ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per antigeni nucleari Sm e/o RNP. Questo siero
mostra una delle reazioni a colorazione a chiazze più
comunemente viste sul substrato cellulare HEp-2 della
IC. La regione cromosomica delle cellule mitotiche
mostra una reazione a colorazione negativa.
controllo positivo nucleolare: numero di catalogo 2023.
Fiala contagocce pronta per l'uso contenente 0,5
ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per antigeni nucleolari. Questo siero dimostra
una reazione a colorazione nucleolare sul substrato
cellulare HEp-2 della IC.
controllo positivo centromero: numero di catalogo
2025. Fiala contagocce pronta per l'uso contenente
0,5 ml di siero di controllo umano positivo con anticorpo
specifico per centromeri cromosomici (cinetocore).
Questo siero mostra una discreta reazione a colora-
zione a chiazze sul substrato cellulare HEp-2 della IC. La
regione cromosomica delle cellule mitotiche mostra la
stessa discreta reazione a colorazione a chiazze.
Siero di controllo titolabile: numero di catalogo 2026.
Fiala pronta per l'uso contenente 1,0 ml di siero di
controllo umano positivo da trattare come campione
del paziente, non diluito. Vedere l'etichetta della fiala
per il valore del titolo.
Siero di controllo negativo: numero di catalogo 2031.
Fiala contagocce pronta per l'uso contenente 1,0 ml
di siero di controllo umano negativo. Sebbene il siero di
controllo negativo possa dimostrare una debole fluo-
rescenza del citoplasma con colorazione più brillante
della regione non cromosomica della cellula mitotica,
esso dimostra un pattern non distinguibile di colorazione
nucleare.
Reagente anticorpo fluorescente: numero di catalogo
2009 (9,0 ml), 2075 (23 ml).
Anti-IgG umane di capra (catene pesanti e leggere)
coniugata con FITC (fluorescein isothiocyanate, fluo-
resceina isotiocianato). Il reagente è pronto all'uso e si
presenta in flaconi contagocce di precisione con 9,0 ml
per ogni 10 vetrini in kit di analisi completi.
† Questo vetrino è protetto da uno o più dei seguenti
brevetti statunitensi e stranieri: 4387972; D-274261; D-
273261; brevetto canadese 1171302 ed altri brevetti in
corso di registrazione.
rEagEntI non rEattIVI
tampone impregnato di polvere PBS: numero di
catalogo 1011. Polvere salina tamponata al fosfato
(0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Ciascuna busta contiene polvere
tamponata sufficiente a fare 1 litro. (Nei kit di analisi
completi, viene fornita una busta di polvere tamponata
per cinque vetrini).
Preparazione: sciogliere una bustina di polvere tam-
ponata in un (1) litro di acqua deionizzata o distillata,
coprire, e conservare in frigorifero ad una temperatura
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