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Questo controllo titolabile mostrerà il tipico pattern a
chiazze associato all'anticorpo RNP. Può essere presen-
te, però, anche un secondo pattern di NSp I (parecchie
chiazze discrete nel nucleo delle cellule interfase), che
comunque è il tipico pattern a chiazze RNP da usare
per leggere il punto di equivalenza della reazione.
I valori ottenuti nel nostro laboratorio possono essere
diversi dai vostri. Di seguito sono indicati alcuni tra i fat-
tori che possono influenzare i risultati.
1. Il tipo di fonte luminosa usata. Fonti luminose al
mercurio producono una maggiore energia di
eccitazione a 495 nm rispetto a quelle al quarzo/
alogene. Le fonti luminose al mercurio da 50 watt,
100 watt e 200 watt differiscono poco nell'energia
di eccitazione a 495 nm. Fonti luminose al quarzo/
alogene da 100 watt generano una maggiore
energia di eccitazione a 495 nm rispetto a quelle al
quarzo/alogene da 50 watt.
2. La condizione e l'età della fonte di luce. Questo
in particolare per le fonti luminose al mercurio
che in genere mostrano una graduale riduzione
nell'energia di eccitazione a 495 nm prima di
esaurirsi. Questa riduzione graduale dell'energia
di eccitazione può comportare una significativa
perdita di sensibilità dopo diverse settimane.
Questo problema può essere evitato tenendo una
registrazione dei tempi. Per risultati ottimali, sostituire
le lampadine a mercurio da 50 watt dopo 100 ore
e quelle da 100 o 200 watt dopo 200 ore. Le fonti lu-
minose al quarzo/alogene in genere non mostrano
una graduale riduzione dell'energia di eccitazione
prima di esaurirsi.
3. Il tipo di filtro di eccitazione usato. I filtri eccitatori
ad interferenza danno maggiore sensibilità in una
lunghezza d'onda molto più ridotta rispetto ai filtri
eccitatori ad assorbimento. Per maggiori informazi-
oni, consultare il manuale del proprio microscopio
a fluorescenza o contattare il rappresentante.
4. Il giusto allineamento del percorso ottico del
microscopio. Per istruzioni, consultare il manuale del
proprio microscopio a fluorescenza.
5. L'apertura numerica dell'obiettivo. Con fluorescen-
za a luce incidente (Epi), la fluorescenza cresce in
modo esponenziale man mano che aumenta an-
che l'apertura numerica (NA) dell'obiettivo. Questo
può far sì che un obiettivo da 40X con una NA di
0,65 legga una o più diluizioni più basse rispetto ad
un obiettivo da 40X con un NA di 0,85. L'apertura
numerica è stampata sul lato dell'obiettivo.
6. I filtri a soppressione. I filtri a soppressione riducono
le specifiche lunghezze d'onda dell'eccitazione
e possono essere usati per ridurre la sensibilità.
Per maggiori informazioni, vedere il manuale del
proprio microscopio a fluorescenza o contattare il
rappresentante.
7. La precisione e l'accuratezza della tecnica di dilu-
izione, dell'apparecchiatura e della performance
delle procedure di analisi.
IntErPrEtazIonE DEI rISultatI DEl PazIEntE
Per lo screening positivo/negativo si raccomanda un
ingrandimento di 200X totali, mentre per il riconosci-
mento del pattern e per visualizzare le cellule mitotiche
si raccomanda un ingrandimento di 400X totali.
negativo: un siero si considera negativo per gli anticorpi
antinucleari se la colorazione nucleare è minore o
uguale al pozzetto di controllo negativo con nessun
pattern chiaramente distinguibile. Il citoplasma può
mostrare una debole colorazione con colorazione più
brillante della regione non cromosomica delle cellule
mitotiche, ma senza alcun pattern nucleare chiara-
mente distinguibile.
Positivo: un siero si considera positivo se il nucleo mostra
un pattern di colorazione chiaramente distinguibile
nella maggior parte delle cellule interfase.
titoli: nel leggere i titoli, molti laboratori iniziano a leg-
gere dal pozzetto contenente il campione più diluito
e leggono "all'indietro" fino alla diluizione 1:40. Il primo
pozzetto in cui è visibile un pattern chiaramente distin-
guibile è il punto di equivalenza della reazione. Rac-
comandiamo questa tecnica per determinare i punti di
equivalenza della reazione. È importante che l'intensità
della colorazione non venga confusa con la presenza
o l'assenza di anticorpi antinucleari. Il fattore chiave
da considerare nel determinare se una data diluizione
del siero è positiva è l'aspetto del pattern chiaramente
distinguibile, indipendentemente dall'intensità della
colorazione.
attenzione: alcuni sieri possono mostrare una colora-
zione nucleare e citoplasmatica senza alcun pattern
nucleare apparente. Questo fenomeno in genere è
dovuto agli anticorpi eterofili e deve essere riportato
come negativo.(31)
IntEnSItà DElla FluorEScEnza
L'intensità della fluorescenza può essere semiquantifi-
cata attraverso le seguenti linee guida per i reagenti
di anticorpi fluorescenti stabilite dai CDC (Centers for
Disease Control and Prevention, Centri per il controllo e
la prevenzione delle patologie) di Atlanta, Georgia.
4+ Giallo-verde brillante (fluorescenza massima):
profilo cellulare netto, centro della cellula net-
tamente definito.
3+ Fluorescenza giallo-verde meno brillante: profilo
cellulare netto, centro della cellula nettamente
definito.
2+ Pattern cellulare definito ma fluorescenza debole:
profilo cellulare ben definito.
1+ Fluorescenza molto tenue: nella maggior parte
dei casi profilo cellulare quasi non distinguibile dal
centro della cellula.
Per la determinazione di queste intensità di fluorescenza
è disponibile il vetrino standard FITC QC Slide™, numero
di catalogo 1900, della Immuno Concepts, N.A. Ltd.
rIPorto DEI rISultatI
Screening: i risultati vanno riportati come fortemente
positivi o positivi alla diluizione 1:40 e va riportato il pat-
tern della colorazione nucleare.
titoli: i risultati vanno riportati come ultima diluizione
del siero in cui si vede una colorazione chiaramente
distinguibile. I risultati con una forte reazione alla
diluizione di 1:2560 vanno riportati come maggiori
di 1:2560. Titoli da 1:40 a 1:80 sono considerati bassi;
da 1:160 a 1:320 sono considerati medi e da 1:640 e
maggiori sono considerati alti.
rIlEVamEnto DEl PattErn
omogeneo: una colorazione del nucleo uniforme, con
o senza mascheramento apparente dei nucleoli. La
regione cromosomica delle cellule mitotiche metafase
è chiaramente positiva con una intensità di colorazione
liscia o periferica maggiore o uguale ai nuclei interfase.
Sinonimi: diffuso; uniforme.
Antigeni nucleari: dsDNA; nDNA; DNP; istone.
Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono
SLE (Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritema-
toso sistemico). Titoli bassi suggeriscono SLE o altre
patologie del tessuto connettivo.(32)
Periferico: una colorazione uniforme, principalmente
intorno alle regione esterna del nucleo con colorazione
più debole verso il centro del nucleo. La regione cro-
mosomica delle cellule mitotiche metafase è chiara-
mente positiva con una intensità di colorazione liscia o
periferica maggiore o uguale ai nuclei interfase.
Sinonimi: bordato, scabro, membranoso.
Antigeni nucleari: dsDNA, ssDNA, nDNA; DNP; istone.
Associazione con patologie: titoli bassi suggeriscono
SLE; titoli bassi suggeriscono SLE o altre patologie
del tessuto connettivo.(32)
a chiazze: una colorazione grossolana o finemente
granulare del nucleo in genere senza colorazione
fluorescente dei nucleoli. La regione non cromosomica
delle cellule mitotiche metafase mostra colorazione,
mentre la regione cromosomica è negativa alla
colorazione.
Antigeni nucleari: Sm; RNP; Scl-70; SSA; SSB; e altri
sistemi antigene/anticorpo non ancora carat-
terizzati.
Associazione con patologie: titoli alti suggeriscono
SLE (antigene Sm), malattia mista del tessuto con-
nettivo (antigene RNP), sclerodermia (antigene
Scl-70) o complesso sindrome di Sjögren-sicca
(antigene SSA o SSB). Titoli bassi possono suggerire
SLE o altre patologie del tessuto connettivo.(33)
nucleolare: grande colorazione a chiazze grossolana
all'interno del nucleo, in genere meno di 6 per cellula,
con o senza chiazze sottili occasionali in numero di 5-10.
La regione non cromosomica delle cellule mitotiche
metafase mostra una forte colorazione, mentre la
regione cromosomica può mostrare una colorazione
tenue. Cellule anafase e telofase possono mostrare una
colorazione simile ai nuclei interfase.
Antigeni nucleari: in genere chiamati 4-6s RNA e altri
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