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Anhang B
Assay-Design und Validierung
Assay-Design
Die Pyrosequenzierungs-Assays können Sie mit der jeweils
neuesten Version der PyroMark Assay Design Software
(ADSW) konfigurieren. Das Programm generiert automatisch
Primer-Sets, die sowohl PCR- als auch Sequenzierungs-
Primer beinhalten. Jedes Primer-Set erhält einen Qualitäts-
Score, der auf der Grundlage mehrerer Parameter vergeben
wird, die für die Pyrosequenzierungs-Analyse spezifisch sind.
Vergewissern Sie sich, dass Sie den richtigen Assay-Typ in
der PyroMark ADSW gewählt haben. Wir empfehlen, die
IVD-gekennzeichneten Assay-Kits von QIAGEN für die
Pyrosequenzierung zu verwenden, in denen alle
notwendigen, optimierten Primer enthalten sind.
PCR
Für die PCR-Amplifikation empfehlen wir, den PyroMark PCR
Kit von QIAGEN zu verwenden, der speziell für die Pyro-
sequenzierungs-Analyse optimiert ist und die hoch
spezifische und fehlerfreie Amplifikation der Template-DNA
für unterschiedliche Pyrosequenzierungs-Applikationen wie
Detektion von Mutationen, SNP-Analysen, Methylierungs-
analyse und Basenzuordnung („Base-calling"). Das
praktische Master-Mix-Format ermöglicht die spezifische
Amplifikation von unterschiedlichen Ausgangsmaterialien wie
genomische DNA verschiedener Spezies oder bisulfit-
konvertierter DNA nach demselben Protokoll.
PCR-Primer
Einer der Primer muss biotinmarkiert sein, um die
Immobilisierung an streptavidinbeschichtete Beads
(Streptavidin Sepharose High Performance; von GE
Healthcare) während der Präparation der einzelsträngigen
DNA-Template zu ermöglichen. Der Assay kann entweder in
Vorwärts- oder Rückwärts-Richtung ablaufen. Beim Primer-
PyroMark Q24 MDx Handbuch 01/2016
Anhang B
B-1
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