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Anhang B
Design mit der PyroMark ADSW wird der Primer, der
biotinyliert werden muss, angezeigt.
Der biotinylierte Primer sollte mittels HPLC oder nach einem
vergleichbaren Verfahren gereinigt sein, weil freies Biotin mit
dem biotinylierten PCR-Produkt um Bindungsstellen auf den
streptavidinbeschichteten Sepharose-Beads konkurriert.
Länge des Amplikons
Die optimale Amplikonlänge für Pyrosequenzierungs-Assays
liegt zwischen 80 und 200 bp, aber auch mit Produkten von
bis zu 500 bp sind evtl. gute Ergebnisse möglich. Amplikons
für CpG-Assays sollten idealerweise kürzer als 200 bp sein.
Sequenzierungs-Primer
Konfigurieren Sie die Sequenzierungs-Primer mit der
PyroMark ADSW. Beim Design eines „InDel"-Assays
empfiehlt es sich unbedingt, dass sich der Sequenzierungs-
Primer ein paar Basen vor der variablen Position befindet.
Wir empfehlen, die IVD-gekennzeichneten Assay-Kits von
QIAGEN für die Pyrosequenzierung zu verwenden, in denen
alle notwendigen, optimierten Primer enthalten sind.
PCR-Setup
Für die PCR unter Verwendung des PyroMark PCR Kits
werden Reaktionen mit einem Volumen von 25 µl angesetzt.
Halten Sie sich dabei genau an die Anweisungen im
PyroMark PCR Handbuch.
Führen Sie die PCR bei optimaler Annealing-Temperatur und
mit 45 Zyklen durch. Bei einer kleineren Zyklenzahl könnte
es aufgrund von überschüssigem biotinyliertem Primer zu
unzureichender Ausbeute und Hintergrundproblemen bei
den Pyrosequenzierungsreaktionen kommen.
Das PCR-Produkt sollte in einem analytischen Agarosegel
eine stark angefärbte Bande mit nur minimalem Überschuss
an Primern ergeben.
B-2
PyroMark Q24 MDx Handbuch 01/2016
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