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Anhang B
Handbuchs) oder finden Sie auf unserer Website
www.qiagen.com.
Menge der Ausgangs-Template
Die Annealing-Effizienz eines Primers an die Template ist ein
wichtiger Faktor bei der PCR. Aufgrund der thermodyna-
mischen Natur der Reaktion beeinflusst das Primer/Tem-
plate-Verhältnis sehr stark die PCR-Spezifität und -Effizienz
und sollte daher empirisch optimiert werden. Wenn zu wenig
Template eingesetzt wird, könnten die Primer ihre
Komplementärsequenzen eventuell nicht finden. Zu viel
Template könnte dazu führen, dass es häufiger zu
Fehlhybridisierungen der Primer kommt.
PCR-Optimierung
Der PyroMark PCR Kit ergibt in den meisten Fällen
zufriedenstellende Ergebnisse. Sollte eine höhere
Mg
Kit mitgelieferte Lösung (25 mM MgCl
Die empfohlene Annealing-Temperatur beträgt 60 °C bzw.
56 °C bei genomischer DNA bzw. bisulfitbehandelter DNA
(bei Verwendung der PyroMark ADSW 2.0).
Die Zugabe von Q-Solution
Kits) kann die PCR-Ausbeute und -Spezifität bei schwierigen
Templates – z. B. bei solchen, die einen hohen Anteil an
Sekundärstrukturen haben – oder bei GC-reichen Templates
verbessern.
Untersuchen Sie bei PCR-Optimierungen jeweils 5 µl einer
25-µl-PCR in einem analytischen Agarosegel – Ziel ist eine
stark angefärbte, spezifische Bande bei gleichzeitig geringem
Überschuss an Primern.
Weitere Hinweise zur Optimierung und Fehlersuche finden
Sie im PyroMark PCR Handbuch.
B-4
2+
Konzentration erforderlich sein, empfehlen wir, die im
PyroMark Q24 MDx Handbuch 01/2016
) zu benutzen.
2
®
(Bestandteil des PyroMark PCR
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