Prelievo E Preparazione Dei Campioni In Vitro Solo Per Uso Ricerca - peviva M30 Apoptosense ELISA Gebrauchsanweisung

Instruzioni per l'uso
essere congelati-scongelati senza perdita di attività (Ref. 6, 7), ma si raccomanda
di evitare cicli ripetuti e non necessari di ricongelamento-scongelamento. Per la
diluizione dei campioni, si veda la sezione "Caratteristiche delle prestazioni".
Prelievo e preparazione dei campioni in vitro
solo per uso ricerca
ELISA M30 Apoptosense è stato utilizzato per applicazioni di colture cel-
lulari in un certo numero di studi pubblicati (per i riferimenti andar al sito
www.vlvbio.com). Peviva ha sviluppato un prodotto specifico per la coltura delle
cellule in vitro, M30 CytoDeath™ ELISA (PEVIVA Prod No 10900). Questo prodotto
ha un intervallo dinamico e una sensibilità tali da essere adatto per i lavori in
vitro.
Per il rilevamento dell'apoptosi di cellule derivate da colture epiteliali con ELISA
M30 Apoptosense, si possono utilizzare i seguenti procedimenti.
Preparazione del campione da colture cellulari
Per molte applicazioni conviene misurare la reattività totale a M30 (ccK18) in
un singolo punto tardivo. Queste misure riflettono una valutazione integrata
dell'apoptosi. Per determinare i frammenti ccK18 totali nei mezzi di coltura cellu-
lare e negli estratti cellulari, aggiungere un detergente non-ionico direttamente
alle cellule nel mezzo di coltura.
Giorno 1: piastrare le cellule. La densità iniziale deve essere determinata
per ogni tipo di cellula e agente citotossico; solitamente, sono sufficienti
5.000–10.000 cellule per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.
Giorno 2: lavare le cellule una sola volta con PBS e aggiungere mezzo fresco
(200 μl/pozzetto). Esporre le cellule all'agente (o agli agenti) desiderato (i).
Giorno 2–4: Per piastre da 96 pozzetti contenenti 200 µl di mezzo per pozzetto,
aggiungere 10 µl di NP 40 10 % per pozzetto. Lasciare lisare le cellule agitando
la piastra con un agitatore a rotazione per 5 minuti a temperatura ambiente.
Si raccomanda di miscelare delicatamente, pipettando i campioni, facendo
attenzione a non creare bolle d'aria; trasferire quindi 2 × 25 µl di mezzo/lisato
nei pozzetti di un M30 Coated Microstrips.
Preparazione del campione da sovranatanti di colture cellulari
ELISA M30 Apoptosense e ELISA M65® possono essere impiegati per stabilire la
modalità di morte cellulare mediante il calcolo di un "rapporto M30:M65" (Ref. 3).
Tali misurazioni devono essere eseguite usando i sovranatanti! Il rapporto
deve essere calibrato per ogni linea cellulare di carcinoma mediante controlli
appropriati: noti induttori di apoptosi (p. es. agenti genotossici, staurosporina)
e/o principalmente di necrosi (p. es. oligomicina/privazione del glucosio o acqua
ossigenata).
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