In Vitro-Probengewinnung Und -Handhabung Für Die Forschung - peviva M30 Apoptosense ELISA Gebrauchsanweisung

Gebrauchsanweisung
Bewahren Sie die Proben bis zu 4 Stunden bei 2 – 8 °C auf. Bei längerer Lagerung
müssen die Proben bei mindestens -20 °C eingefroren werden. Das Einfrieren
und Auftauen der Proben beeinträchtigt zwar deren Reaktivität nicht (Ref. 6, 7),
doch sollte es nicht unnötig erfolgen. Bezüglich der Verdünnung der Proben sie-
he Abschnitt „Testcharakterisierung".
In vitro-Probengewinnung und -Handhabung
für die Forschung
Der M30 Apoptosense ELISA wurde in zahlreichen veröffentlichten Studien in
Zell kulturanwendungen verwendet (Referenzen siehe www.vlvbio.com). Peviva
hat ein spezielles Produkt für in vitro-Zellkulturen entwickelt, den M30 Cyto­
Death™ ELISA
(PEVIVA Prod. Nr. 10900). Der dynamische Bereich und die
Sensitivität dieses Produkts sind der in vitro-Anwendung angepasst.
Die folgenden Protokolle können zum Nachweis der Apoptose in epithelialen
Zellkulturen mithilfe des M30 Apoptosense ELISA verwendet werden.
Handhabung der Proben aus Zellkulturen
In vielen Anwendungen ist es von Vorteil, die Gesamtreaktivität von M30 (ccK18)
einmalig zu einem späten Zeitpunkt zu messen. Solche Messungen repräsentie-
ren eine integrierte Bewertung der Apoptose. Zur Bestimmung des Gesamtge-
halts von ccK18 Fragmenten in Zellkulturmedien und Zellextrakten füge man
nichtionische Tenside direkt zu den Zellen im Gewebekulturmedium hinzu.
Tag 1: Aussäen der Zellen. Die Saatdichte richtet sich nach der spezifischen Zell-
art und dem jeweiligen zytotoxischen Mittel; 5.000 – 10.000 Zellen pro Mulde in
einer 96-Testmuldenplatte sind im Allgemeinen ausreichend.
Tag 2: Zellen einmal mit PBS waschen und frisches Medium (200 µl/Mulde) zu-
geben. Die Zellen werden mit der/den gewünschten Testsubstanz(en) versetzt.
Tag 2 – 4: Für 96-Testmuldenplatten, die 200 µl Medium pro Mulde enthalten,
10 µL 10 % NP-40 pro Mulde hinzufügen. Zur Ausführung der Lyse die Platte auf
einem Rotationsschüttler bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubieren. Zur
Verbesserung des Mischergebnisses wird empfohlen, das Medium/Lysat zuvor
vorsichtig auf und ab zu pipettieren; dabei darauf achten, dass die Probe nicht
schäumt. Überführung von 2 × 25 µl des Mediums/Lysates in die Mulden der M5
Coated Microstrips.
Handhabung der Proben aus Zellkulturüberständen
M30 Apoptosense ELISA und M65® ELISA kann zur Bewertung der Art des Zell-
todes durch Berechnung eines M30:M65-Verhältnisses (Ref. 3) verwendet wer-
den. Die Erstellung eines derartigen Verhältnisses sollte allerdings auf die Be-
stimmung von Zellkulturüberständen beschränkt sein. Dieses Verhältnis sollte
für jede Karzinomzelllinie mit geeigneten Kontrollen kalibriert werden, d. h. mit
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