Provtagning Och Hantering Av Prover För Utvecklingsändamål - peviva M30 Apoptosense ELISA Gebrauchsanweisung

Bruksanvisning
Provtagning och hantering av prover för utvecklingsändamål
M30 Apoptosense ELISA har använts för mätningar i cellkulturer i flera publi-
cerade studier (se www.vlvbio.com för referenser). Peviva har utvecklat en
specifik produkt för in vitro-cellkulturer, M30 CytoDeath™ ELISA (PEVIVA prod.
nr 10900). Denna produkt har ett dynamiskt spann och en känslighet anpassad
för in vitro-arbete.
Följande protokoll kan användas för att mäta apoptos i cellkulturer av epitelialt
ursprung med M30 Apoptosense ELISA.
Preparering av prover från cellsuspension
För många användningsområden är det en fördel att mäta den totala M30-
aktiviteten (ccK18) vid en enda tidpunkt efter tillsats av ett apoptosframkallande
stimulus. Genom att välja en sen tidpunkt kommer sådana mätningar att
återspegla en integrerad uppskattning av apoptosen. För att mäta de totala
nivåerna av ccK18-fragmentet i odlingsmedium och cellextrakt tillsättes
detergent till odlingsmediet.
Dag 1: Så ut cellerna. Celltätheten måste bestämmas för varje celltyp och
cytotoxiskt ämne; 5 000 till 10 000 celler per brunn i en 96-brunnsplatta är
normalt tillräckligt.
Dag 2: Tvätta cellerna en gång med PBS och tillsätt färskt medium (200 µl/brunn).
Behandla cellerna med önskade ämnen.
Dag 2–4: Tillsätt 10 µl 10 % NP-40 per brunn i 96-brunnsplattor (innehållande
200 µl medium per brunn; slutkoncentration 0,5 %). Skaka plattan 5 minuter i
rumstemperatur så att cellerna lyseras. Det rekommenderas att medium/lysat
sugs upp och ner i pipetten för att erhålla tillräcklig blandning. Överför 2 × 25 µl
av medium/lysat till en M30 Coated Microstrips.
Preparering av prover från cellsupernatant
M30 Apoptosense ELISA och M65® ELISA kan användas för att fastställa typ
av celldöd genom att beräkna kvoten mellan M30 och M65 (ref. 3). Sådana
mätningar ska göras med mediumsupernatanter! Kvoten bör kalibreras för
varje carcinomcellinje med hjälp av lämpliga kontroller, som t ex kända ämnen
som orsakar apoptos (t. ex. genotoxiska ämnen eller staurosporin) och/eller
huvudsakligen nekros (oligomycin/glukossvält eller väteperoxid).
Dag 1/dag 2: Så ut cellerna, tvätta och tillsätt ämnen på samma sätt som vid
användning av cellsuspension.
Dag 2–4: Sug upp ett prov från varje brunn. För att undvika uttorkning av
brunnar rekommenderas att flera prover inte tas ur samma brunn. Centrifugera
mediet och samla upp den vätska som inte innehåller celler. OBS! Undvik att få
med celler! Använd 2 × 25 µl av denna vätska vid varje test.
Sida 22