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Voraussetzungen für das
Prelabeling von Proben mittels
des Western
Prelabeling-Protokolls
Kompatible Lysepuffer
Gemeinsame Lysepuffer auf TRIS-Basis mit pH 7 bis 9 und mit unterschiedlichen Deter-
genzien und Salzen sind kompatibel mit der Vormarkierung von Zell-/Gewebeproben,
zum Beispiel:
•
•
Proben-pH-Wert
Der Proben-pH-Wert sollte zwischen 7 und 9 liegen.
Optimaler pH-Wert ist nicht entscheidend für die Zelllysate und Gewebeextrakte, da eine
hohe Empfindlichkeit für das Gesamtproteinsignal nicht erforderlich ist. Das Gesamtpro-
teinsignal in einem Western Experiment mit Gesamtproteinnormalisierung sollte propor-
tional zur Proteinmenge (nicht abhängig von hoher Empfindlichkeit) sein.
Erforderliche Lösungen und
Materialien
Für das Prelabeling von Proteinen sind die folgenden Lösungen und Materialien erforder-
lich:
•
•
•
•
•
•
•
•
Amersham WB system Bedienungsanleitung 29-0214-77 AE
Zudem variieren die Markierungsleistungen zwischen verschiedenen
Proteinen.
GE Säugetier-Proteinextraktionspuffer
RIPA-Puffer
Prelabeling-Verbrauchsmaterialien: Cy5-Farbreagens, Markierungspuffer, Ladepuffer
1 M DTT (Dithiothreitol)-Stammlösung (DTT und Reinstwasser), wenn eine reduzierende
SDS-PAGE durchgeführt wird
Reinstwasser zur Verdünnung des Cy5-Farbstoffreagenz
Original-Lysepuffer zur Anpassung des Reaktionsvolumens (nur Western Experimente)
0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen
Heizblock
Vortex
Zentrifuge
5 Durchführen eines Experiments
5.4 Durchführen des Prelabelings von Proben
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