Endress+Hauser analytik jena Biometra TAdvanced 96 Bedienungsanleitung Seite 49

Biometra TAdvanced
Berechnungsgrundlage
Haltezeit für Elongationsschritt
berechnen
Alternativ kann der Wizard für Sie die Werte für T
¡
quenz für den Vorwärts- und Rückwärtsprimer berechnen. Dabei können Sie die
Konzentration von Primer und Salzen in der Berechnung berücksichtigen. Nach dem
Speichern übernehmen Sie die berechnete Annealingtemperatur einfach in ein PCR-
Programm.
Mit einem gradientenfähigen Thermocycler können Sie die theoretische Annealing-
¡
temperatur mit einem Gradienten-Programm prüfen und weiteroptimieren.
Für kurze Sequenzen von ≤14 Nukleotiden:
Die Software berechnet die Primer-Annealingtemperatur (T
Werte wie folgt:
¡ Für jeden Primer berechnet die Software die Schmelztemperatur mit der Gleichung
nach Wallace et al.:
T = ((w*A + x*T)*2) + ((y*G + z*C)*4)
m
Dabei stehen w, x, y und z für die Anzahl der Basen A, T, G und C in der Primerse-
quenz.
¡ Der durchschnittliche T
¡ Die Annealingtemperatur T
der folgenden Regeln berechnet:
Wenn die Differenz zwischen den T
Wenn die Differenz zwischen den T
plus 2 °C.
Bei langen Primersequenzen von >14 Nukleotiden:
Die Software berechnet die Primer-Annealingtemperatur (T
neighbor method nach SantaLucia und von Ahsen et. al..
Berechnungsgrundlage
Gleichung nach Wallace et al.
Nearest neighbor method
Die Software berechnet die Haltezeit für den Elongationsschritt auf Grundlage der er-
warteten Produktlänge gemäß folgender Gleichung:
Elongationszeit s = Produktlänge Basen/1000 Basen*60 s
Für sehr kurze Produkte ist die Mindest-Elongationszeit in der Software auf 6 s gesetzt.
Wert wird aus den T Werten für beide Primer errechnet.
m m
wird auf Basis des durchschnittlichen T
a
Werten ≤4 °C ist, gilt: T
m
Werten >4 °C ist, gilt: T
m
Quellenangabe
Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543, 1979
SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Feb 17;
95(4):1460-5
von Ahsen et al., Clin Chem. 1999 Dec; 45(12):2094-101
und T anhand der Basense-
a m
) auf Basis der Primer T
a
Werts gemäß
m
= T – 5 °C
a m
ist unterer T
a m
) auf Basis der nearest
a
Bedienung
m
Wert
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