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NovaSeq 6000 Handbuch zum Sequenziersystem
Base-Calling
Beim Base-Calling wird eine Base (A, C, G oder T) für jeden Cluster einer bestimmten Platte eines
bestimmten Zyklus festgelegt. Das NovaSeq 6000-Sequenziersystem verwendet die Zweikanal-
Sequenzierung, die nur zwei Bilder benötigt, um die Daten für vier DNA-Basen zu codieren: ein Bild aus dem
roten Kanal und ein Bild aus dem grünen Kanal.
Das Ergebnis „No-Call" wird als N identifiziert. „No-Calls" treten auf, wenn Cluster die Filter nicht passieren,
die Registrierung fehlschlägt oder Cluster außerhalb des Bildes verschoben werden.
Intensitäten für jeden Cluster werden aus den roten und grünen Bildern extrahiert und miteinander
verglichen. Dies ergibt vier verschiedene Populationen. Jede Population entspricht einer Base. Der Base-
Calling-Prozess bestimmt, zu welcher Population jeder Cluster gehört.
Abbildung 32 Darstellung der Clusterintensitäten
Tabelle 22 Base-Calls bei einer Zweikanal-Sequenzierung
Roter
Base
Kanal
A
1 (ein)
C
1 (ein)
G
0 (aus)
T
0 (aus)
Cluster nach Filterung
Während des Laufs filtert RTA3 Rohdaten, um Reads zu entfernen, die dem Schwellenwert für Datenqualität
nicht genügen. Überlappende Cluster sowie Cluster niedriger Qualität werden entfernt.
Bei der Zweikanalanalyse verwendet RTA3 ein populationsbasiertes System zum Feststellen der Reinheit
(Reinheitsmessung der Intensität) eines Base-Calls. Cluster passieren Filter (PF), wenn nicht mehr als ein
Base-Call in den ersten 25 Zyklen eine Reinheit unter einem festen Schwellenwert aufweist. Das PhiX-
Alignment wird im Zyklus 26 für eine Teilmenge von Platten für Cluster durchgeführt, die die Filter passiert
haben. Für Cluster, die die Filter nicht passieren, erfolgt kein Base-Call und kein Alignment.
Dokument-Nr. 1000000019358 v08 DEU Material-Nr. 20023471
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
Grüner
Ergebnis
Kanal
1 (ein)
Cluster, die Intensitäten sowohl im roten als auch im grünen Kanal aufweisen.
0 (aus)
Cluster, die Intensitäten nur im roten Kanal aufweisen.
0 (aus)
Cluster, die keine Intensitäten bei einer bekannten Clusterposition aufweisen.
1 (ein)
Cluster, die Intensitäten nur im grünen Kanal aufweisen.
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