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illumina NextSeq 2000 Handbuch
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Sequenziersystem
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NextSeq 2000
Handbuch zum Sequenziersystem
Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU
Juni 2020
Nur für Forschungszwecke.
Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
ILLUMINA – EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT

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Verwandte Anleitungen für illumina NextSeq 2000

Inhaltszusammenfassung für illumina NextSeq 2000

  • Seite 1 NextSeq 2000 Handbuch zum Sequenziersystem Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU ILLUMINA – EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT Juni 2020 Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
  • Seite 2 VERWENDUNG DER HIERIN BESCHRIEBENEN PRODUKTE (EINSCHLIESSLICH TEILEN HIERVON ODER DER SOFTWARE) ENTSTEHEN. © 2020 Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten. Alle Marken sind Eigentum von Illumina, Inc. bzw. der jeweiligen Eigentümer. Weitere Informationen zu Marken finden Sie unter www.illumina.com/company/legal.html. Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU...
  • Seite 3 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Versionshistorie Dokument-Nr. Datum Beschreibung der Änderung 1000000109376 Juni Software-Beschreibungen zur NextSeq 1000/2000 Control 2020 Software aktualisiert. Unterscheidung zwischen den Modi Cloud, Hybrid, Local und Standalone im gesamten Handbuch verdeutlicht. Anweisungen zum Lagern und Auftauen von Kartuschen aktualisiert. Angaben zur Anzahl unterstützter Zyklen aktualisiert. Anweisungen zur Konfiguration der Sekundäranalyse aktualisiert.

  • Seite 4: Inhaltsverzeichnis

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Inhaltsverzeichnis Systemüberblick Weitere Ressourcen Gerätehardware Integrierte Software Process Management (Prozessmanagement) Diagramm zum Sequenzierungsprotokoll Funktionsweise der Sequenzierung Systemkonfiguration Anforderungen in Bezug auf Benutzerkonten Konfigurieren von BaseSpace Sequence Hub und Proactive Support Festlegen des Standardspeicherorts für den Ausgabeordner Importieren anwendungsspezifischer Referenzgenome Konfigurieren des Laufmodus Geräteanpassung Verbrauchsmaterialien und Ausstattung...
  • Seite 5 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Austauschen des Luftfilters Fehlerbehebung Beheben von Fehlermeldungen Erneutes Lagern von Verbrauchsmaterialien Abbrechen eines Laufs Erneutes Stellen eines Laufs in die Warteschlange Aus- und Wiedereinschalten des Geräts Wiederherstellen der Werkseinstellungen Speichern eines Systemimages Wiederherstellen eines gespeicherten Images Quellen und Verweise Einstellungen für Probenblätter der Version 2 Index Technische Unterstützung...

  • Seite 6: Systemüberblick

    ® Das Illumina NextSeq™ 2000-Sequenziersystem bietet einen gezielten Ansatz für NGS . Das anwendungsorientierte System bündelt die Sequenzierungstechnologie von Illumina in einem kostengünstigen Tischgerät mit folgenden Merkmalen: • Benutzerfreundlichkeit und Zugänglichkeit: Das NextSeq 2000 bietet die lokale DRAGEN- Analyse sowie geräteinterne Denaturierung und Verdünnung. Ein Bildgebungsmodul ist in das System integriert und Fluidikkomponenten sind in das Verbrauchsmaterial integriert, was die Wartung des Geräts vereinfacht.

  • Seite 7: Weitere Ressourcen

    Indexadapter Pooling- Enthält Anweisungen zum Pooling sowie Handbuch (Dokument- Verfahrensbeschreibungen zur doppelten Indizierung. Nr. 1000000041074) Illumina-Adaptersequenzen Enthält eine Liste mit Adaptersequenzen für Illumina- (Dokument- Bibliotheksvorbereitungskits. Nr. 1000000002694) Gerätehardware Das NextSeq 2000-Sequenziersystem verfügt über eine Ein/Aus-Taste, einen Monitor, eine Statusleiste, eine Verbrauchsmaterialienkammer und USB-Anschlüsse.

  • Seite 8: Stromanschluss Und Andere Anschlüsse

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Abbildung 1 Externe Systemkomponenten A. Luftfilterkammer: Bietet Zugang zum austauschbaren Luftfilter. B. Touchscreen-Monitor: Ermöglicht die Systemkonfiguration und -einrichtung am Gerät über die Benutzeroberfläche der Steuerungssoftware. C. Statusleiste: Das farbige Licht zeigt den Fortschritt des Workflows an. Blau und Lila zeigen Interaktionen (z. B.
  • Seite 9 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Abbildung 2 Komponenten auf der Rückseite A. Kippschalter: Zum Ein- und Ausschalten des Geräts. B. Stromanschluss: Für den Anschluss des Netzkabels. C. Ethernet-Anschlüsse: Zum Anschluss des optionalen Ethernet-Kabels. D. USB-Anschluss (3.0): Für den Anschluss einer externen Festplatte für die Datenübertragung. Verbrauchsmaterialienkammer Die Verbrauchsmaterialienkammer enthält die Kartusche einschließlich der Fließzelle und der verdünnten Bibliothek für den Sequenzierungslauf.

  • Seite 10: Integrierte Software

    Universal Copy Service sind ausschließlich Hintergrundprozesse. Informationen zum System Auf den Bereich „About“ (Info) können Sie über das Menü der Steuerungssoftware oben links zugreifen. Im Bereich „About“ (Info) finden Sie Kontaktdaten von Illumina und folgende Systeminformationen: • Seriennummer des Geräts •...

  • Seite 11: Process Management (Prozessmanagement)

    Process Management (Prozessmanagement) Der Bildschirm „Process Management“ (Prozessmanagement) zeigt temporäre Läufe an, die unter /usr/local/illumina/runs gespeichert wurden. Für alle Läufe werden das Datum, der Name und die ID angezeigt. Außerdem werden für die einzelnen Läufe Informationen zum Status von Lauf, Sekundäranalyse, Ausgabeordner und Cloud angezeigt. Wählen Sie den Lauf, um zusätzliche Informationen wie Workflow, Average % Q30 (Durchschnitt % Q30), Total PF Reads (PF-Reads insgesamt) und Total Yield (Gesamtergebnis) anzuzeigen.

  • Seite 12: Diagramm Zum Sequenzierungsprotokoll

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch • Wenn der Lauf nicht ausgeführt wird, schalten Sie das Gerät aus und wieder ein und öffnen Sie anschließend den Bildschirm „Process Management“ (Prozessmanagement) erneut. Siehe Aus- und Wiedereinschalten des Geräts auf Seite Diagramm zum Sequenzierungsprotokoll Das folgende Diagramm stellt das Sequenzierungsprotokoll des NextSeq 2000 dar. Funktionsweise der Sequenzierung Die Sequenzierung mit dem NextSeq 2000-Sequenziersystem umfasst die Clusterbildung, die Sequenzierung und die Analyse.

  • Seite 13: Sequenzierung

    Sekundäranalyse. Die Methode der sekundären Datenanalyse ist abhängig von Ihrer Anwendung und der Systemkonfiguration. Sekundäranalyse BaseSpace Sequence Hub ist die Cloud-Computing-Umgebung von Illumina für die Laufüberwachung, Datenanalyse, Speicherung und Zusammenarbeit. Sie hostet DRAGEN- und BaseSpace Sequence Hub- Apps für gängige Analysemethoden zur Sequenzierung.
  • Seite 14 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch • Weitere Informationen zu BaseSpace Sequence Hub finden Sie in der Onlinehilfe zu BaseSpace Sequence Hub. • Weitere Informationen zu DRAGEN finden Sie auf der Supportseite zur DRAGEN Bio-IT-Plattform. • Eine Übersicht aller Apps finden Sie unter BaseSpace-Apps. Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke.

  • Seite 15: Systemkonfiguration

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Systemkonfiguration Dieser Abschnitt enthält Informationen zur Einrichtung des Systems, einschließlich der Beschreibung der Softwareeinstellungen. In den Anweisungen wird vornehmlich die Steuerungssoftware beschrieben. Darüber hinaus sind einige Informationen zur Konfiguration von Netzwerk und Betriebssystem enthalten. Bei der Verwendung von Google Chrome auf dem Gerät werden Sie zum Entsperren Ihres Login- Schlüsselbunds aufgefordert.

  • Seite 16: Konfigurieren Von Basespace Sequence Hub Und Proactive Support

    Bei Aktivierung einer Option außer „None“ (Keine) ist Proactive Support aktiviert. Hierbei handelt es sich um einen kostenlosen Service, mit dem Sie Ihre Leistungsdaten auf dem MyIllumina-Kunden-Dashboard anzeigen können und der es den Serviceteams von Illumina ermöglicht, Fehler schneller zu beheben. „Proactive and Run Monitoring“ (Proactive und Laufüberwachung) ist standardmäßig aktiviert. Wählen Sie None (Keine), um den Dienst zu deaktivieren.

  • Seite 17: Festlegen Des Standardspeicherorts Für Den Ausgabeordner

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Festlegen des Standardspeicherorts für den Ausgabeordner Legen Sie mithilfe der Anweisungen in diesem Abschnitt den Standardspeicherort für den Ausgabeordner fest. Sie können den Ausgabeordner für einzelne Läufe während der Laufkonfiguration ändern. Die Software speichert cBCL-Dateien und andere Laufdaten im Ausgabeordner. Es ist ein Ausgabeordner erforderlich, sofern BaseSpace Sequence Hub nicht für „Proactive, Run Monitoring and Storage“ (Proactive, Laufüberwachung und -speicherung) konfiguriert ist.
  • Seite 18 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wählen Sie unter „Favorites“ (Favoriten) die Option Terminal. Geben Sie sudo touch /root/.smbcreds ein und drücken Sie anschließend die Eingabetaste. Geben Sie sudo gedit /root/.smbcreds ein und drücken Sie dann die Eingabetaste, um die Textdatei „smbcreds“ zu öffnen. Geben Sie nach dem Öffnen der Textdatei .smbcreds Ihre Anmeldeinformationen im folgenden Format ein.

  • Seite 19: Anweisungen Zum Mounten Von Nfs

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Anweisungen zum Mounten von NFS Wählen Sie bei geöffneter NextSeq 1000/2000 Control Software Minimize Application (Anwendung minimieren). Melden Sie sich beim Konto „ilmnadmin“ an. Ermitteln Sie den Servernamen für den NFS-Server. Der Servername darf keine Leerzeichen enthalten. Beispiel: Servername: 192.168.500.100 oder Meinserver-meininstitut-03 Wählen Sie Applications (Anwendungen).

  • Seite 20: Konfigurieren Des Laufmodus

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Erstellen Sie mithilfe der BaseSpace Sequence Hub-App Reference Builder for Illumina Instruments ein Referenzgenom. Weitere Informationen finden Sie in der Onlinehilfe zur App Reference Builder for Illumina Instruments v1.0.0. Melden Sie sich beim Konto „ilmnadmin“ an. Wählen Sie das Menü der Steuerungssoftware und dann Process Management (Prozessmanagement).

  • Seite 21: Erwägungen Hinsichtlich Probenblättern Für Den Local- Und Den Standalone-Modus

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Die BaseSpace Sequence Hub-Funktion zum erneuten Stellen in die Warteschlange ist nur verfügbar, wenn Proactive, Run Monitoring and Storage (Proactive, Laufüberwachung und -speicherung) ausgewählt ist. Mit dieser Funktion lassen sich fehlerhafte Datenblätter korrigieren und die Demultiplexing-Analyse erneut in die Warteschlange stellen. Informationen dazu, wie Sie im Gerät einen Lauf erneut in die Warteschlange stellen, finden Sie unter Erneutes Stellen eines Laufs in die Warteschlange auf Seite...

  • Seite 22: Konfigurieren Von Software-Updates

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Konfigurieren von Software-Updates Wählen Sie im Menü der Steuerungssoftware die Option Settings (Einstellungen). Wählen Sie, ob die Prüfung auf Software-Updates vom System automatisch durchgeführt werden soll: • Wenn die Prüfung automatisch erfolgen soll, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Autocheck for software updates (Automatisch auf Software-Updates prüfen).

  • Seite 23: Verbrauchsmaterialien Und Ausstattung

    Ausstattung Sie für die Wartung und die Problembehebung benötigen. Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Für die Sequenzierung mit dem NextSeq 2000 ist ein Illumina NextSeq 1000/2000 P2 Reagents-Kit für den Einmalgebrauch erforderlich. Das Kit ist in drei Größen erhältlich (100, 200 und 300 Zyklen). Das NextSeq 1000/2000 P2 Reagents-Kit umfasst eine Kartusche und eine Fließzelle für die Sequenzierung.
  • Seite 24 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch A. Kunststoffkartusche B. Fließzelle C. Graue Lasche Die innere Oberfläche der Fließzelle ist mit Millionen von Nanowells versehen. Es werden Cluster in den Nanowells gebildet, aus denen dann die Sequenzierungsreaktion durchgeführt wird. Die strukturierte Anordnung der Nanowells erhöht die Anzahl der Ausgabe-Reads und -daten. Kartusche Die Sequenzierungsreagenzienkartusche ist mit Cluster-, Sequenzierungs-, Paired-End- und Indizierungsreagenzien vorbefüllt.

  • Seite 25: Unterstützte Anzahl Von Zyklen

    Das Datum, an dem das Verbrauchsmaterial abläuft. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie das Verbrauchsmaterial vor diesem Datum. Gibt den Hersteller an (Illumina). Die Verwendung ist ausschließlich für Forschungszwecke (Research Use Only, RUO) vorgesehen. Gibt die Artikelnummer an, damit das Verbrauchsmaterial identifiziert werden kann.¹...

  • Seite 26: Zusätzliche Verbrauchsmaterialien

    Für die Sequenzierung und die Wartung sind folgende Verbrauchsmaterialien erhältlich. Verbrauchsmaterialien für die Sequenzierung Tabelle 3 Verbrauchsmaterialien für die Sequenzierung Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck Einweg-Handschuhe, ungepudert Allgemeiner Laborlieferant Allgemeine Verwendung. NextSeq 1000/2000 P2 Reagents Illumina: Enthält die Katalog-Nr. 20043738 Reagenzienkartusche und (100 Zyklen) die Fließzelle für einen Katalog-Nr. 20043737 Lauf. (200 Zyklen) Katalog-Nr. 20043736 (300 Zyklen)

  • Seite 27: Verbrauchsmaterialien Für Die Wartung

    Zweck Pipettenspitzen, 200 µl Allgemeiner Laborlieferant Verdünnen von Bibliotheken. Pipettenspitzen, 1.000 µl Allgemeiner Laborlieferant Durchstechen der Folie des Bibliotheksbehälters. Resuspension Buffer Illumina, wird mit den Verdünnen von (Resuspensionspuffer, RSB) Bibliotheksvorbereitungskits Bibliotheken auf geliefert Ladekonzentration. [Optional] 10 mM Tris-HCl mit Allgemeiner Laborlieferant Ersatz für RSB zum 0,1 % Tween 20, pH 8,5...

  • Seite 28: Zusätzliche Ausstattung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Zusätzliche Ausstattung Für die Sequenzierung ist folgende Ausstattung erforderlich. Element Quelle Zweck Gefrierschrank, -25 °C bis -15 °C Allgemeiner Lagern der Kartusche. Laborlieferant Eiskübel Allgemeiner Lagerung der Bibliotheken bis zur Laborlieferant Sequenzierung. Pipette, 10 µl Allgemeiner Verdünnen von Bibliotheken auf Laborlieferant Ladekonzentration.

  • Seite 29: Protokoll

    Read trägt zu einer optimalen Datenausgabe bei. Ladevolumen und -konzentrationen Das Ladevolumen beträgt 20 µl. Die Ladekonzentration variiert je nach Bibliothekstyp: Bibliothekstyp Ladekonzentration (pM) AmpliSeq™ for Illumina Library PLUS Illumina DNA Prep Illumina DNA Prep with Enrichment 1.000 100 % PhiX TruSeq DNA Nano 350 1.200...

  • Seite 30: Anzahl Der Zyklen In Einem Read

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Anzahl der Zyklen in einem Read Die Eingabe von mindestens 26 Zyklen und maximal 151 Zyklen pro Read hilft, die Datenqualität sicherzustellen. Die genaue Anzahl der Zyklen hängt von Ihrem Versuch ab. Die NextSeq 1000/2000 Control Software erfordert mindestens einen Zyklus für Read 1, zeigt jedoch eine Warnung an, wenn die Anzahl der Zyklen für Read 1 kleiner als 26 ist.
  • Seite 31 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch • Local (Lokal): Analyse der Sequenzierungsdaten im Gerät oder Generieren eines Probenblatts der Version 2 für den Local-Modus. Wählen Sie einen Analysetyp und eine Version. Weitere Informationen zur Sekundäranalyse finden Sie unter Ausgabedateien der DRAGEN- Sekundäranalyse auf Seite 49 oder in der Dokumentation zur BaseSpace Sequence Hub-App.

  • Seite 32: Konfigurieren Der Sekundäranalyse

    Wählen Sie Next (Weiter). Konfigurieren der Sekundäranalyse Konfigurieren Sie die Einstellungen des für den Lauf ausgewählten Analysetyps. Illumina DRAGEN BCL Convert Konfigurieren Sie die Illumina DRAGEN BCL Convert-Analyse anhand der folgenden Schritte. Geben Sie die folgenden optionalen Einstellungen ein. Einstellung Beschreibung AdapterRead1 Adaptersequenz für Read 1.
  • Seite 33 Diese Option ist nur verfügbar, wenn „Local“ (Lokal) als Analysesort ausgewählt wurde. Illumina DRAGEN Enrichment Konfigurieren Sie die Illumina DRAGEN Enrichment-Analyse anhand der folgenden Schritte. Wählen Sie ein Referenzgenom. Verwenden Sie, wenn möglich, ein ALT-sensibles Referenzgenom. Wählen Sie eine *.bed-Datei mit den gewünschten Zielregionen aus oder laden Sie eine neue anwendungsspezifische Datei hoch.

  • Seite 34: Auftauen Der Im Folienbeutel Verpackten Kartusche

    Modus zu starten. Diese Option ist nur verfügbar, wenn „Local“ (Lokal) als Analysesort ausgewählt wurde. Illumina DRAGEN RNA Konfigurieren Sie die Illumina DRAGEN RNA-Analyse anhand der folgenden Schritte. Wählen Sie Ihr Referenzgenom. Verwenden Sie, wenn möglich, ein nicht ALT-sensibles Referenzgenom. Wählen Sie Ihr Mapping/Alignment-Ausgabeformat.

  • Seite 35: Auftauen In Einem Geregelten Wasserbad

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Abbildung 4 Im Folienbeutel verpackte Kartusche Auftauen in einem geregelten Wasserbad Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderter Handschuhe an und entnehmen Sie die Kartusche aus dem Lagerort. Entnehmen Sie die Kartusche aus dem Karton, öffnen Sie jedoch nicht den Silberfolienbeutel. Das Auftauen eines beschädigten Beutels in einem Wasserbad kann dazu führen, dass die Sequenzierung fehlschlägt.

  • Seite 36: Auftauen In Einem Kühlschrank

    Basenvarianz kann der Prozentwert des PhiX-Spike-ins erhöht werden. Die Bibliotheken werden automatisch im Gerät denaturiert. Diese Anweisungen gelten für unterstützte doppelstrangige Illumina-Bibliotheken. Führen Sie stets eine Qualitätskontrollanalyse durch, optimieren Sie die Ladekonzentration für Ihre Bibliothek und wenden Sie ein Normalisierungsverfahren an, bei dem doppelsträngige Bibliotheken generiert werden. Die beadbasierte Normalisierung, bei der einzelsträngige Bibliotheken generiert werden, ist nicht mit der...

  • Seite 37: Vorbereiten Von Fließzelle Und Kartusche

    Mischen Sie die folgenden Volumina in einem Low-Binding-Röhrchen, um 24 µl einer auf die entsprechende Ladekonzentration verdünnten Bibliothek vorzubereiten: Ladekonzentration Volumen 2-nM- Volumen Bibliothekstyp* (pM) Bibliothek (µl) RSB (µl) Ampliseq for Illumina Library PLUS Illumina DNA Prep Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.

  • Seite 38: Hinzufügen Einer Phix-Kontrolle (Optional)

    * Beginnen Sie bei nicht aufgeführten Bibliothekstypen mit einer Ladekonzentration von 650 pM und optimieren Sie diese im Verlauf der weiteren Läufe. Diese Tabelle enthält Beispielladekonzentrationen. Das NextSeq 2000 ist mit allen Illumina- Bibliotheksvorbereitungskits kompatibel, die keine anwendungsspezifischen Sequenzierungs-Primer benötigen. Die optimale Ladekonzentration kann jedoch variieren.

  • Seite 39: Laden Von Verbrauchsmaterialien In Die Kartusche

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Laden von Verbrauchsmaterialien in die Kartusche Mit diesem Schritt werden die vorgefüllten Reagenzien gemischt und die verdünnten Bibliotheken sowie die Fließzelle geladen, um die Kartusche für die Sequenzierung vorzubereiten. Vorbereiten der Kartusche Öffnen Sie den Beutel der Kartusche, indem Sie ihn an einer der oberen seitlichen Einkerbungen aufreißen oder mit einer Schere aufschneiden.

  • Seite 40: Laden Der Bibliotheken

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Schieben Sie die Fließzelle in die Aussparung auf der Vorderseite der Kartusche. Ein hörbares Klicken gibt an, dass die Fließzelle richtig positioniert ist. Wenn die Kartusche korrekt geladen ist, steht die graue Lasche aus der Kartusche hervor. Ziehen Sie die graue Lasche ab, um die Fließzelle freizulegen. Führen Sie die Lasche dem Recycling zu.

  • Seite 41: Starten Eines Sequenzierungslaufs

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Bewegen Sie die Pipettenspitze langsam zum Behälter boden und geben Sie 20 µl verdünnte Bibliothek auf den Boden des Behälters. Achten Sie darauf, die Folie nicht zu berühren. Starten eines Sequenzierungslaufs Bei diesem Schritt wird ein Sequenzierungslauf in einem von vier Modi gestartet: •...

  • Seite 42: Starten Eines Lokalen Laufs

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wählen Sie Start (Starten). Geben Sie Ihre Anmeldedaten für BaseSpace Sequence Hub ein und wählen Sie anschließend Sign In (Anmelden). Wenn Sie „Proactive, Run Monitoring and Storage“ (Proactive, Laufüberwachung und -speicherung) gewählt haben, wählen Sie die in BaseSpace Sequence Hub unter „Instrument Run Setup“  (Gerätelaufkonfigutation) erstellte Arbeitsgruppe, die Ihren Lauf enthält.

  • Seite 43: Initiieren Eines Eigenständigen Laufs

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch • Gerätelaufkonfiguration verwendet: Wählen Sie den ZIP-Ordner mit dem Probenblatt Version 2 und ggf. den ergänzenden Dateien. Wählen Sie andernfalls das Probenblatt der Version 2. • Gerätelaufkonfiguration nicht verwendet: Stellen Sie sicher, dass sich die ergänzende Datei für die Sekundäranalyse im selben Verzeichnis befindet wie das Probenblatt der Version 2. Das ausgewählte Probenblatt muss im Format Version 2 vorliegen.

  • Seite 44: Laden Der Verbrauchsmaterialien In Das Gerät

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Geben Sie die in jedem Read ausgeführte Anzahl der Zyklen ein: Die maximale Anzahl der Index-Zyklen ist unbegrenzt, jedoch muss die Summe der Read-Zyklen und der Index-Zyklen kleiner als die Anzahl der auf dem Etikett der Kartuschen angegebenen Zyklen plus 27 sein.

  • Seite 45: Selbsttests

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Setzen Sie die Kartusche mit der Kennzeichnung nach oben auf den Träger, die Fließzelle weist dabei ins Innere des Geräts. Drücken Sie die Kartusche auf den Träger, bis die Befestigungselemente einrasten. Wählen Sie Close (Schließen), um die Kartusche einzuziehen und die Blende zu schließen. Die NextSeq 1000/2000 Control Software zeigt nach zwei Minuten Informationen zu den gescannten Verbrauchsmaterialien an.

  • Seite 46: Überwachen Des Lauffortschritts

    Entsorgen Sie die Fließzelle, die elektronische Komponenten enthält, gemäß den geltenden Vorschriften Ihrer Region. [Optional] Entfernen Sie den Drainageverschluss unter dem Illumina-Logo an der Seite der Kartusche über einem geeigneten Bereich (z. B. Waschbecken oder Behälter für gefährliche Flüssigkeitsabfälle). Der Verschluss muss dabei horizontal oder nach unten weg von Ihrem Gesicht weisen.
  • Seite 47 Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden regionalen, nationalen und lokalen Gesetzen und Vorschriften. Zusätzliche umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie in den Sicherheitsdatenblättern (SDS, Safety Data Sheet) unter support.illumina.com/sds.html. Entsorgen Sie die Kartusche (ggf. mit nicht verbrauchten Reagenzien) gemäß den geltenden Vorschriften Ihrer Region.

  • Seite 48: Sequenzierungsausgabe

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Sequenzierungsausgabe In diesem Abschnitt wird die Real-Time Analysis-Software beschrieben, mit der Base-Calling, Zuweisung von Qualitäts-Scores und Datenausgabe erfolgen. Sie erhalten Informationen zu den unterschiedlichen Ausgabedateitypen und dazu, wo diese nach dem Lauf gespeichert werden. Überblick über Real-Time Analysis Das NextSeq 2000-Sequenziersystem führt RTA3 aus, eine Implementierung der Real-Time Analysis- Software auf dem CE-Gerät (Compute Engine).

  • Seite 49: Fließzellenplatten

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, werden die folgenden Protokolldateien an das endgültige Ausgabeziel übertragen: info_00000.log enthält eine Zusammenfassung wichtiger Laufereignisse. error_00000.log protokolliert während des Laufs aufgetretene Fehler. warning_00000.log protokolliert während des Laufs aufgetretene Warnungen. Fließzellenplatten Platten sind kleine Bildgebungsbereiche auf der Fließzelle. Die Kamera nimmt ein Bild je Platte auf. Die NextSeq 1000/2000 P2-Fließzelle enthält 132 Platten.

  • Seite 50: Real-Time Analysis-Workflow

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Real-Time Analysis-Workflow Registrierung Zeichnet die Position jedes Clusters auf der strukturierten Fließzelle auf. Intensitätsextraktion Bestimmt einen Intensitätswert für jeden Cluster. Korrektur der Korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und Vorphasierung. Phasierung Base-Calling Legt für jeden Cluster einen Base-Call fest. Qualitätsbewertung Weist jedem Base-Call einen Qualitäts-Score zu.
  • Seite 51 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Abbildung 5 Phasierung und Vorphasierung A. Read mit einer phasierenden Base B. Read mit einer vorphasierenden Base RTA3 korrigiert die Auswirkungen der Phasierung und der Vorphasierung, sodass bei jedem Zyklus des Laufs eine maximale Datenqualität erzielt wird. Base-Calling Beim Base-Calling wird eine Base (A, C, G oder T) für jeden Cluster einer bestimmten Platte eines bestimmten Zyklus festgelegt.

  • Seite 52: Cluster Nach Filterung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Abbildung 6 Darstellung der Clusterintensitäten Die Farbe der einzelnen Cluster entspricht den %Base-Graphen im Sequenzierungsanalyse- Viewer (SAV) und BaseSpace Sequence Hub Run Data by Cycle. Eine Entsprechung zum grünen und blauen Kanal ist nicht vorgesehen. Cluster nach Filterung Während des Laufs filtert RTA3 Rohdaten, um Reads zu entfernen, die dem Schwellenwert für Datenqualität nicht genügen.

  • Seite 53: Qualitätsbewertung Und Berichterstellung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Q-Score Q(X) Fehlerwahrscheinlichkeit 0,0001 (1 von 10.000) 0,001 (1 von 1.000) 0,01 (1 von 100) 0,1 (1 von 10) Qualitätsbewertung und Berichterstellung Die Qualitätsbewertung berechnet für jeden Base-Call mehrere Fehlerwahrscheinlichkeiten und ermittelt anhand der Prognosewerte den Q-Score aus einer Qualitätstabelle. Qualitätstabellen werden erstellt, um optimale Qualitätsprognosen für Läufe zu liefern, die auf spezifisch konfigurierten Sequenzierungsplattformen mit bestimmten Chemie-Versionen durchgeführt werden.

  • Seite 54: Sequenzierungsausgabedateien

    Informationen zu Ausgabedateien. Zusätzlich zur Generierung von spezifischen Dateien für die einzelnen Pipelines stellt DRAGEN Analysemetriken in einer <Probenname>.metrics.json-Datei und die unter Illumina DRAGEN BCL Convert-Pipeline auf Seite 51 erläuterten Berichte bereit. Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
  • Seite 55 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Erwägungen zu Ausgabedateien: • FASTQ-Dateien werden nur generiert, wenn die BCL Convert-Pipeline bei der Geräteanalyse verwendet wird. Bei anderen Pipelines werden keine FASTQ-Dateien generiert. FASTQ-Dateien werden nicht auf BaseSpace Sequence Hub hochgeladen, wenn „Proactive, Run Monitoring and Storage“ (Proactive, Laufüberwachung und -speicherung) ausgewählt ist. •...
  • Seite 56 <Probenname>.quant.sf • Alle Ergebnisse der Transkript-Quantifizierung. Illumina DRAGEN BCL Convert-Pipeline Die DRAGEN BCL Convert-Pipeline verwendet aus dem Sequenzierungslauf generierte BCL-Daten und Probenblattinformationen zur Ausgabe einer FASTQ-Datei für jede Probe. Der Name der FASTQ-Datei lautet <Probenname>.fastq.gz. Die Pipeline generiert die folgenden Berichte.

  • Seite 57: Bericht Zur Demultiplexing-Statistik

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Bericht zur Demultiplexing-Statistik Der Bericht zur Demultiplexing-Statistik enthält Informationen zur Anzahl der Reads nach Filterung, die jeder Probe im Probenblatt zugewiesen sind. Alle Reads, die sich nicht eindeutig einer Probe zuordnen lassen, werden als „undetermined“ (unbestimmt) gekennzeichnet. Außerdem enthält dieser Bericht Informationen zu den Qualitäts-Scores der Basen in den Reads nach Filterung (Passing Filter, PF), die jeder Probe zugewiesen sind.

  • Seite 58: Bericht Zur Index-Hopping-Zählung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Metrik Beschreibung index2 Die index2-Sequenz aus dem Probenblatt. Das Feld ist leer, wenn im Probenblatt kein Wert für „index2“ angegeben wurde oder der Wert für die Proben-ID undetermined (unbestimmt) lautet. R1_AdapterBases Anzahl der Basen für AdapterRead1 im Probenblatt. R1_SampleBases Anzahl der getrimmten oder maskierten Basen von Read 1 für die entsprechende Lane und die entsprechende Probe.

  • Seite 59: Bericht Zu Den Häufigsten Unbekannten Barcodes

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Bericht zu den häufigsten unbekannten Barcodes Der Bericht zu den häufigsten unbekannten Barcodes enthält die 100 häufigsten Indexeinträge oder Indexpaare je Lane, die nicht im Probenblatt gemäß der Anzahl zulässiger Nichtübereinstimmungen angegeben wurden. Wenn mehrere Indexwerte als 100. Indexeintrag angegeben werden, werden alle Indexwerte mit derselben Anzahl als 100.
  • Seite 60 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch logs *.txt *.csv RunInstrumentAnalyticsMetrics 0001 dataset.json 0002  dataset.json Reports Demultiplex_Stats.csv RunInfo.xml Trim_Metrics.csv fastq_list.csv SampleSheet.csv Index_Hopping_Counts.csv Top_Unknown_Barcodes.csv Read1InstrumentAnalyticsMetrics 0001 dataset.json 0002 dataset.json Read1Metrics Demultiplex_Stats.csv Trim_Metrics.csv Index_Hopping_Counts.csv Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.

  • Seite 61: Wartung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wartung In diesem Abschnitt werden die erforderlichen Maßnahmen erläutert, mit denen der ordnungsgemäße Zustand des Systems gewährleistet wird. Erfahren Sie, wie Sie Software-Updates installieren, den Luftfilter austauschen und andere regelmäßige Wartungsarbeiten ausführen. Wenn die Steuerungssoftware aktuell gehalten wird, verfügt Ihr System stets über die neuesten Fehlerbehebungen sowie Funktionen und gewährleistet damit die optimale Leistung.

  • Seite 62: Installieren Eines Automatischen Software-Updates

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch • Manuelle Updates: Updates werden manuell aus dem Internet heruntergeladen, lokal oder auf einem tragbaren Laufwerk gespeichert und von diesem Speicherort aus installiert. Für diese Option ist keine Internetverbindung für das Gerät erforderlich. Installieren eines automatischen Software-Updates Melden Sie sich beim Konto „ilmnadmin“ an. Stellen Sie sicher, dass derzeit weder ein Sequenzierungslauf noch eine Sekundäranalyse im Gerät durchgeführt wird.

  • Seite 63: Pipeline- Und Lizenz-Updates Für Dragen

    Aktualisieren Sie die Lizenz für die DRAGEN Bio-IT-Plattform wie folgt, wenn das NextSeq 2000- Sequenziersystem über eine Internetverbindung verfügt. Wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina, um einen neuen Lizenzschlüssel zu beantragen. Warten Sie 24 Stunden, bis die Lizenz automatisch aktualisiert wurde, oder aktualisieren Sie die Lizenz unmittelbar, wie im Folgenden beschrieben.

  • Seite 64: Austauschen Des Luftfilters

    Dies sorgt für die erforderliche Kühlung und verhindert, dass Fremdkörper in das System eindringen. Das Gerät wird mit einem eingebauten und einem Ersatzluftfilter geliefert. Zusätzliche Ersatzteile sind in einem gültigen Gerätewartungsvertrag enthalten oder können bei Illumina erworben werden. Drücken Sie, wie in der folgenden Abbildung dargestellt, auf die rechte Seite der oberen Abdeckung auf der Oberseite des Geräts, um sie zu entriegeln.
  • Seite 65 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Setzen Sie einen neuen Luftfilter in die Aufnahme ein. Drücken Sie auf den Luftfilter, bis dieser einrastet. Schließen Sie die obere Abdeckung. Drücken Sie anschließend auf die Abdeckung, bis diese einrastet. Stellen Sie das Gerät wieder an seinen ursprünglichen Standort. Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke.

  • Seite 66: Fehlerbehebung

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Fehlerbehebung Dieser Abschnitt enthält ausführliche Informationen zum Abbrechen eines Laufs, zum Aus- und Wiedereinschalten des Geräts sowie zu weiteren Fehlerbehebungsverfahren. Beheben von Fehlermeldungen In diesem Anhang finden Sie detaillierte Anweisungen zur Problembehebung. Das folgende Ablaufdiagramm enthält eine Übersicht zur Problembehebung bei Fehlermeldungen, die während der Initialisierung, der Laufkonfiguration oder der Sequenzierung angezeigt werden und sich durch eine Wiederholung nicht beheben lassen.

  • Seite 67: Abbrechen Eines Laufs

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Bereiten Sie eine neue Verdünnung derselben Bibliothek für den nächsten Lauf vor, um eine Kreuzkontaminierung mit Bibliotheksresten im Behälter zu verhindern. Platzieren Sie die Kartusche bei einer Lagertemperatur von 2 °C bis 8 °C mit dem Etikett nach oben und so, dass Luft an allen Seiten zirkulieren kann. Diese Lagerung darf 72 Stunden nicht überschreiten.

  • Seite 68: Aus- Und Wiedereinschalten Des Geräts

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wenn Sie das Probenblatt auf einem tragbaren Laufwerk gespeichert haben, schließen Sie das Laufwerk an einen der USB 3.0-Anschlüsse auf der Seite oder auf der Rückseite des Geräts an. Bewegen Sie das Gerät ggf. vorsichtig, um die Anschlüsse auf der Rückseite zu erreichen. Wählen Sie das Menü...

  • Seite 69: Wiederherstellen Der Werkseinstellungen

    Setzen Sie das System auf die Werkseinstellungen zurück, um ein Downgrade der Software durchzuführen oder das System nach einer unerwünschten Konfiguration wiederherzustellen. Diese Funktion darf nur von einem Illumina-Mitarbeiter verwendet werden. Speichern eines Systemimages Durch Speichern eines Systemimages lässt sich eine funktionierende Softwareinstallation sichern.

  • Seite 70: Wiederherstellen Eines Gespeicherten Images

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Wiederherstellen eines gespeicherten Images Unerwünschte Konfigurationen lassen sich durch Wiederherstellen eines zuvor gespeicherten Systemimages beseitigen. Starten Sie Linux neu. Wählen Sie Restore Installed Image (Systemimage wiederherstellen), wenn Sie zur Auswahl eines Betriebssystems aufgefordert werden. Die Betriebssystemoptionen werden kurz angezeigt, bevor automatisch die NextSeq 1000/2000 Control Software gestartet wird.

  • Seite 71: Quellen Und Verweise

    Im Local-Modus können Sie ein Probenblatt im Dateiformat Version 2 für die Konfiguration der Laufeinstellungen verwenden. Erstellen Sie unter „Instrument Run Setup“ (Gerätelaufkonfiguration) ein Probenblatt oder bearbeiten Sie die Datei NextSeq 2000 Sequencing System Sample Sheet v2 Template. Stellen Sie beim Bearbeiten des Probenblatts sicher, dass die folgenden Abschnitte und Felder in der aufgeführten Reihenfolge enthalten sind und die Anforderungen erfüllen.

  • Seite 72: Bcl-Konvertierung - Anforderungen

    Settings] und [BCLConvert_Data]. In die Abschnitte zur BCL-Konvertierung müssen Angaben zu Indexadaptersequenzen eingefügt werden. Informationen zur Ermittlung der passenden Adaptersequenz für die einzelnen Reads und Läufe finden Sie unter Illumina-Adaptersequenzen (Dokument- Nr. 1000000002694). Im Folgenden finden Sie die verfügbaren Felder für [BCLConvert_Settings] und die entsprechenden Beschreibungen.

  • Seite 73: Einstellungen Für Dragen-Probenblätter

    NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Feld Erforderlich Beschreibung OverrideCycles Nein Zeichenfolge zur Angabe der UMI-Zyklen und zum Ausschluss von Zyklen aus einem Read. Folgende Werte sind zulässig: • N: Gibt die zu ignorierenden Zyklen an. • Y: Gibt die Sequenzierungszyklen an. • I: Gibt die Indexzyklen an. •...

  • Seite 74: Anforderungen Für Die Dragen Germline-Pipeline

    Der Name des Referenzgenoms. Beispiel: hg19_alt_ aware. Verwenden Sie den Namen des Referenzgenoms unter /usr/local/illumina/genomes. Weitere Informationen zur Verwendung eines anwendungsspezifischen Referenzgenoms finden Sie in der Onlinehilfe zur App Reference Builder for Illumina Instruments v1.0.0 sowie unter Importieren anwendungsspezifischer Referenzgenome auf Seite MapAlignOutFormat Nein Das Format der Ausgabedatei.

  • Seite 75: Anforderungen Für Die Dragen Rna-Pipeline

    Der Name des Referenzgenoms. Beispiel: hg38_noalt_ with_decoy. Verwenden Sie den Namen des Referenzgenoms unter /usr/local/illumina/genomes. Weitere Informationen zur Verwendung eines anwendungsspezifischen Referenzgenoms finden Sie in der Onlinehilfe zur App Reference Builder for Illumina Instruments v1.0.0 sowie unter Importieren anwendungsspezifischer Referenzgenome auf Seite RNAGeneAnnotationFile Nein Die Datei mit RNA-Gen-Annotationen.

  • Seite 76: Anforderungen Für Die Dragen Enrichment-Pipeline

    Der Name des Referenzgenoms. Beispiel: hg38_alt_ aware. Referenzgenome befinden sich unter /usr/local/illumina/genomes. Weitere Informationen zur Verwendung eines anwendungsspezifischen Referenzgenoms finden Sie in der Onlinehilfe zur App Reference Builder for Illumina Instruments v1.0.0 sowie unter Importieren anwendungsspezifischer Referenzgenome auf Seite BedFile Die BED-Datei mit den Zielregionen.

  • Seite 77: Index

    Index Gerätename 16 Betriebssystem 63 %PF 47 Bewegen 4 Bibliotheken Anfangskonzentrationen 32 Alkoholtücher 22 Denaturieren 7 Amplifikation 7 Lagerung 1 nM 32 Analyse Bildanalyse 5 Methoden 5, 8 Bilder 43 Anfangskonzentrationen 32 Bildgebung 43-44 Anhalten von Läufen 62 Bildstreifen 44 Anzahl der Läufe 5 Bleichmitteltücher 22 Audioeinstellungen 16...
  • Seite 78 Verdünnte Bibliotheken 32 Lanes 44 Hilfe, technische 76 Läufe Hosting-Speicherort 11 Kennzahlen 43 Laufgröße 56 Laufordner 56 Illumina Proactive Support 11 Laufparameter Initialisierung 63 Bearbeiten 38 Fehlschlag 63 Laufstatus 6 Installation der Software 56 Laufwerk D 56 Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU...
  • Seite 79 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Leistungsdaten 11 PF (Passing Filter, nach Filterung) 47 Leuchtbalken 2 Phasierung und Vorphasierung 45 Local Run Manager 5 PhiX 22 Lokale Analyse 1 Alignment 43 Löschen von Läufen 6, 56 PhiX Control v3 21 Lüfter 59 Phred-Algorithmus 48 Luftfilter Platten 43 Ersatzteile 22...
  • Seite 80 NextSeq 2000-Sequenziersystem Handbuch Single-Read 38 Verfallsdatum 59 Software Verlorene Verbindungen 63 Downgrading 64-65 Installation 56 Warnungen 5, 56, 63 Warnungen zu Updates 17 Wechselstrom Software-Suite 1, 5 Anschluss 4 Speicherplatz 6, 56 Werkseinstellungen 64-65 Spezifikationsanpassung 63 Whitepaper 48 Standardausgabeordner 38 Wiederaufnehmen von Läufen 62 Statusleiste 2 Windows Supportseiten 56...

  • Seite 81: Technische Unterstützung

    Spanien +34 911899417 +34 800300143 Taiwan 00806651752 Andere Länder +44.1799.534000 Sicherheitsdatenblätter (SDS, Safety Data Sheets) sind auf der Illumina-Website unter support.illumina.com/sds.html verfügbar. Die Produktdokumentation steht unter support.illumina.com zum Herunterladen zur Verfügung. Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.

  • Seite 82: Dokument-Nr. 1000000109376 V01 Deu

    Dokument-Nr. 1000000109376 v01 DEU Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Kalifornien 92122, USA +1.800.809.ILMN (4566) +1.858.202.4566 (außerhalb von Nordamerika) techsupport@illumina.com www.illumina.com Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren. © 2020 Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten.

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