Endress+Hauser Analytik Jena Biometra Fastblot B43 Bedienungsanleitung Seite 14

Bedienung
Verwendung einer Durchfluss-
kühlung
Einfluss von Methanol
Einfluss von SDS
6.2 Tipps für das Nukleinsäure-Blotting
Vorbehandlung
Puffer
Blottingsandwich
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Die Transferzeit wird auch von der Geldicke und der Acrylamidkonzentration beeinflußt.
Ist die gewählte Transferzeit zu lang, ist es möglich, dass das Protein die Membran pas-
siert und verloren geht. Dies kann mit Hilfe einer zweiten Membran unter der eigentli-
chen Blottingmembran überprüft werden, welche ebenfalls nach dem Transfer auf das
Vorhandensein von Proteinen getestet wird.
In folgenden Fällen wird die Verwendung des Modelles Fastblot B43 mit Kühlungssys-
tem empfohlen:
Übertragung von Proteinen mit einem hohen Molekulargewicht von > 100 kDa
¡
Der Blottingvorgang kann bei großem Molekulargewicht bis zu 30 Minuten dauern.
Ein langer Blottingvorgang erhöht die Gefahr der Überhitzung des Gerätes, was zu
Beschädigung des Gerätes und der Proben führen kann.
¡ Übertragung nativer Proteine oder Enzyme
Der Einsatz von Methanol hat folgende Einflüsse auf den Blottingvorgang:
verbesserte Bindung von Proteinen an Nitrocellulose
¡
Hemmung der Quellung des Gels
¡
¡ potenziell schlechteres Blotting der Proteine (Senkung der Löslichkeit von Protei-
nen)
Der Einsatz von SDS hat folgende Einflüsse auf den Blottingvorgang:
Hemmung der Bindung von Proteinen an die Membran
¡
Gleichmäßige Ladung der Proteine
¡
¡ potentiell Veränderung der antigenen Eigenschaften eines Proteines
Sie können das Blotting-Gerät ebenfalls für den Elektrotransfer von Nukleinsäuren auf
Agarose-Gelen auf eine Membran einsetzen.
Das Gerät ist vorrangig für das Proteinblotting vorgesehen. Beachten Sie deshalb beim
Blotting von Nukleinsäuren die Tipps und Hinweise in diesem Kapitel.
HINWEIS! Besser geeignet für den Transfer von Nukleinsäuren ist der Einsatz der Va-
kuumblotting-Technik (DNA/RNA) bzw. der Kapillarblotting-Technik (RNA).
Zur Steigerung der Blot-Effizienz sollten Proben mit Nukleinsäuren vor dem Transfer
vorbehandelt werden:
Arbeitsschritt
Depurinierung
Denaturierung
Neutralisierung
Das Blotting-Sandwich wird entsprechend dem Vorgehen für das Protein-Blotting auf-
gebaut. Nehmen Sie folgende Änderungen am Vorgehen vor:
Transferpuffer: 1 x TAE oder 1 x TBE
¡
¡ Blottingpapier: je 10 Blatt Whatmann 3MM (getränkt mit Transferpuffer) Oberhalb
und unterhalb des Blot-Sandwiches
Substanz
0,25 M HCl
0,50 M NaOH
1,50 M NaCl
3,00 M NaCl
0,50 M Tris (pH 7,4)
Biometra Fastblot B43 & B44
Zeitintervalll
7 min
15 min
15 min