Vorbereiten Einer Frischen Verdünnung Von Naoh; Denaturieren Von Bibliotheken Und Hinzufügen Einer Optionalen Phix- Kontrolle - illumina cBot 2 Handbuch

Vorbereiten einer frischen Verdünnung von NaOH
1 Mischen Sie die folgenden Volumina in einem Mikrozentrifugenröhrchen:
}
Wasser in Laborqualität (900 µl)
}
Stock 1 N NaOH (100 µl)
Diese Volumina ergeben 1 ml 0,1 N NaOH.
2 Invertieren Sie sie zum Mischen.
Denaturieren von Bibliotheken und Hinzufügen einer optionalen PhiX-
Kontrolle
Die Ladekonzentration der Bibliothek hängt von den zu sequenzierenden Bibliotheken ab.
Die folgenden Anweisungen gelten für TruSeq Nano-DNA-Bibliotheken (350 bp) oder PCR-
freie TruSeq-DNA-Bibliotheken (350 bp). Verdünnen Sie auf eine für den Bibliothekstyp
geeignete Konzentration.
} Eine zu hohe DNA-Ladekonzentration führt zu einem reduzierten %PF (Prozentsatz
der Cluster, die den Filter passieren).
}
Eine zu niedrige DNA-Ladekonzentration führt zu einem reduzierten %PF sowie zu
einem hohen Anteil von Duplikaten, die die Abdeckungstiefe beeinträchtigen.
Wiederholen Sie die folgenden Anweisungen für jede zu sequenzierende Fließzelle.
1 Verdünnen Sie die Bibliothek bzw. die Pool-Bibliotheken auf die entsprechende
Konzentration:
}
TruSeq Nano-DNA-Bibliotheken: Auf 2–3 nM in RSB verdünnen.
}
PCR-freie TruSeq-DNA-Bibliotheken: Auf 1–2 nM in RSB verdünnen.
2 [Optional]
nicht denaturierten Bibliotheken hinzu:
} TruSeq Nano-DNA-Bibliotheken: 0,5 µl 2–3 nM PhiX zu 50 µl 2–3 nM Bibliothek
hinzufügen.
}
PCR-freie TruSeq-DNA-Bibliotheken: 0,5 µl 1–2 nM PhiX zu 50 µl 1–2 nM
Bibliothek hinzufügen.
3 Beschriften Sie die Röhrchen eines 8-fach-Röhrchenstreifens:
}
Clustering mit Probenverfolgung – Beschriften Sie die Röhrchen vom codierten Ende
des Röhrchenstreifens aus mit 8 bis 1.
}
Clustering ohne Probenverfolgung – Beschriften Sie die Röhrchen mit 1 bis 8. Wenn
Sie vier Fließzellen vorbereiten, ist die Verwendung eines weiteren Bezeichners auf
dem 8-fach-Röhrchenstreifen empfehlenswert, um eine ordnungsgemäße
Probenverfolgung sicherzustellen.
4 Denaturieren Sie die Bibliothek im 8-fach-Röhrchenstreifen wie folgt:
a Geben Sie 5 µl nicht denaturierte Bibliothek in den unteren Bereich jedes Wells.
b Fügen Sie 5 µl frisch verdünntes 0,1 N NaOH hinzu. Pipettieren Sie langsam zum
Mischen.
c Inkubieren Sie 8 Minuten lang bei Raumtemperatur.
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Geben Sie mittels Spike-in 1 % nicht denaturierte Illumina-PhiX-Kontrolle zu
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