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Qiagen therascreen KRAS RGQ PCR Handbuch

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therascreen
Handbuch
Version 1
Qualitatives In-vitro-Diagnostikum
Zur Verwendung mit Rotor-Gene
874011
QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House,
Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK
QIAGEN GmbH, QIAGEN-Straße 1,
40724 Hilden, DEUTSCHLAND
R4
1116068DE
KRAS RGQ PCR Kit
®
®
Q MDx
Sample & Assay Technologies
Januar 2019
24

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Verwandte Anleitungen für Qiagen therascreen KRAS RGQ PCR

Inhaltszusammenfassung für Qiagen therascreen KRAS RGQ PCR

  • Seite 1 KRAS RGQ PCR Kit ® Handbuch Version 1 Qualitatives In-vitro-Diagnostikum Zur Verwendung mit Rotor-Gene ® Q MDx 874011 QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, UK QIAGEN GmbH, QIAGEN-Straße 1, 40724 Hilden, DEUTSCHLAND 1116068DE Sample & Assay Technologies...

  • Seite 2: Qiagen Probenvorbereitungs- Und Testtechnologien

    QIAGEN Probenvorbereitungs- und Testtechnologien QIAGEN ist der führende Anbieter von innovativen Probenvorbereitungs- und Testtechnologien zur Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen in biologischen Proben. Unsere fortschrittlichen und qualitativ hochwertigen Produkte und Leistungen sind ein Garant für Erfolg – von der Probenvorbereitung bis hin zum Ergebnis.

  • Seite 3: Inhaltsverzeichnis

    Protokoll: Nachweis von KRAS-Mutationen Interpretation der Ergebnisse Fehlerbehebung Von der therascreen KRAS Assay Package Software angezeigte Markierungen41 Qualitätskontrolle Anwendungseinschränkungen Leistungsmerkmale Analytische Leistung Nachweisgrenze (LOD) DNA-Aufgabe und Linearität Störsubstanzen Kreuzkontamination Exklusivität/Kreuzreaktivität Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit Variabilität der Probenhandhabung therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 4 Äquivalenz der Probengewinnungsmethoden (nur NSCLC) Literatur Symbole Kontakt Anhang 1: therascreen KRAS RGQ PCR Kit – manuelles Protokoll Interpretation der Ergebnisse (manuell) Einstellungen für die Analyse in der Software Analyse der Daten aus der Probenbestimmung Analyse des KRAS-Mutationsnachweises Probenanalyse Anhang 2: Installation der therascreen KRAS Assay Package Software...

  • Seite 5: Verwendungszweck

    Arzt beurteilt, damit eine Therapieentscheidung getroffen werden kann. Therapieentscheidungen für Krebspatienten dürfen keinesfalls ausschließlich auf dem KRAS-Mutationsstatus beruhen. Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist nicht für die Diagnose eines Kolorektal- karzinoms, eines NSCLC oder sonstiger Erkrankungen ausgelegt. Zusammenfassung und Erklärung In menschlichen Karzinomen treten häufig Mutationen des KRAS-Onkogens auf...
  • Seite 6 Nachweisgrenzen für die verschiedenen Mutationen finden Sie unter „Leistungsmerkmale“ auf Seite 50. Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit wird im Rahmen eines PCR-Verfahrens (PCR, Polymerase Chain Reaction) eingesetzt. Dieses Kit zeichnet sich durch eine hohe Spezifität gegenüber der Zielsequenz sowie durch außergewöhnliche Schnelligkeit und Effizienz aus und ermöglicht eine Bestimmung unter Ausschluss...

  • Seite 7: Testprinzip

    Testprinzip Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit verwendet für den Nachweis von Mutanten mittels Echtzeit-PCR 2 Technologien: ARMS und Scorpions. Mutationsreaktionsgemische Die mutierte DNA wird in jedem Reaktionsgemisch mit Hilfe eines mutations- spezifischen ARMS-Primers selektiv amplifiziert und das Amplifikationsprodukt danach mit einem Scorpions-Primer nachgewiesen.
  • Seite 8 Assays Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit beruht auf einem zweischrittigen Verfahren. Im ersten Schritt wird der Kontrollassay durchgeführt, um die gesamte amplifizier- bare KRAS-DNA in einer Probe zu bestimmen. Im zweiten Schritt werden sowohl der Mutations- als auch der Kontrollassay durchgeführt, um zu bestimmen, ob mutierte DNA vorliegt.
  • Seite 9 Wasser als NTC zu verwenden sind. Plattform und Software Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist speziell für den Gebrauch mit dem Rotor-Gene Q MDx Instrument ausgelegt. Die Rotor-Gene Q Software und das therascreen KRAS Assay Package sind als Download oder separat auf CD erhältlich.

  • Seite 10: Mitgelieferte Materialien

    Mintgrün 80 µl (Taq-DNA-Polymerase) Water for NTC Weiß 1,9 ml (Wasser als NTC) Water for Sample Dilution Weiß Dil. 1,9 ml (Wasser zur Probenverdünnung) therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbook (Handbuch in Englisch) therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 11: Zusätzlich Benötigtes Material

    Installation der therascreen KRAS Assay Package Software“ auf Seite 99) Hinweis: Zum manuellen Mutationsnachweis kann die Rotor-Gene Q Software ohne KRAS Assay Package verwendet werden. Siehe „Anhang 1: therascreen KRAS RGQ PCR Kit – manuelles Protokoll“ auf Seite 75. Thermomixer , beheizter Orbitalinkubator, Wärmeblock oder Wasserbad †...

  • Seite 12: Warnhinweise Und Vorsichtsmaßnahmen

    Röhrchen dürfen nach Abschluss des PCR-Laufs nicht geöffnet werden. Auf diese Weise soll eine Kontamination mit PCR-Endprodukten im Labor verhindert werden. Die Reagenzien im therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurden optimal  verdünnt. Eine weitere Verdünnung der Reagenzien wird nicht empfohlen, da dies zu einer Leistungsbeeinträchtigung führen kann.

  • Seite 13: Lagerung Und Handhabung Der Reagenzien

    Moleküle, vor Licht geschützt werden, um Photobleichung zu vermeiden und optimale Aktivität und Leistung sicherzustellen. Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist bei Lagerung unter den empfohlenen Lagerungsbedingungen in der Originalverpackung bis zum Ablauf des ange- gebenen Verfallsdatums stabil. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden.
  • Seite 14 Gewebe ist davon auszugehen, dass sie keine Mutationen enthält, die mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit nachgewiesen werden können. Vorbereitung von Gewebeproben Hinweis: Verwenden Sie trockene Skalpelle. Dieser Schritt darf nicht in einer Laminar-Flow-Sterilbank oder einem Abzug durchgeführt werden.

  • Seite 15: Verfahren

    Verfahren DNA-Extraktion Die Leistungsmerkmale des therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurden anhand von mit dem QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Katalog-Nr. 56404) extrahierter DNA bestimmt. Führen Sie bei Verwendung des QIAamp DNA FFPE Tissue Kit die DNA-Extraktion gemäß den Anweisungen im Handbuch durch. Beachten Sie dabei Folgendes.

  • Seite 16: Protokoll: Dna-Probenbestimmung

    DNA in Proben unter Verwendung der KRAS CE Sample Assessment Locked Template (Assay Package) als Vorlage für die automatische Probenbestimmung. Hinweis: Informationen zur manuellen Probenbestimmung finden Sie unter „Anhang 1: therascreen KRAS RGQ PCR Kit – manuelles Protokoll“ auf Seite 75. Wichtige Hinweise, die vor der Durchführung zu beachten sind Mit dem vorhandenen Kontrollreaktionsgemisch (CTRL) können bis zu...
  • Seite 17 Zur Gewährleistung eines möglichst effizienten Gebrauchs der Reagenzien  des therascreen KRAS RGQ PCR Kits fassen Sie die DNA-Proben zu Chargen zusammen, damit die Testläufe möglichst voll besetzt sind. Durch das Testen einzelner Proben oder kleiner Serien von Proben steigt der Reagenzienverbrauch an, und die Gesamtzahl der Proben, die mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit getestet werden können, nimmt ab.
  • Seite 18 1 Reaktion mit nukleasefreiem Wasser als Nicht-Template-Kontrolle  (NTC) 1 zusätzliche Probe, damit ausreichend Material für die PCR-  Konfiguration vorhanden ist Der Master-Mix enthält mit Ausnahme der Probe alle Komponenten, die für die PCR benötigt werden. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 19 3. Stellen Sie die benötigte Anzahl von PCR-4-Röhrchenstreifen (jeder Streifen besteht aus 4 Röhrchen) gemäß der Anordnung in Tabelle 4 in den Lade- block. Verschließen Sie die Röhrchen nicht. Hinweis: Die Deckel verbleiben im Kunststoffbehälter, bis sie benötigt werden. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 20 Röhrchen, die sich in jedem PCR-4-Röhrchenstreifen in der Position mit der niedrigsten Nummer befinden (z. B. Positionen 1, 5 und 9 usw.), um beim Laden der Röhrchen in den 72-Well-Rotor des Rotor-Gene Q MDx Instruments die Ausrichtung anzuzeigen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 21 Vorlage, indem Sie auf dem Desktop des Notebooks, das an das Rotor- Gene Q MDx Instrument angeschlossen ist, auf das Symbol „therascreen KRAS QC Locked Template“ klicken (siehe Abbildung 1). Abbildung 1. Das Symbol „therascreen KRAS QC Locked Template“. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 22 Attached“ (Schließring angebracht). Schließen Sie den Deckel des Rotor- Gene Q MDx Instruments. Abbildung 2. Registerkarte „Setup“ mit dem Kontrollkästchen „Locking Ring Attached“. 1 = Registerkarte „Setup“ (Konfiguration), 2 = Kontrollkästchen „Locking Ring Attached“ (Schließring angebracht). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 23 Abbildung 3. Eingabe von Testlauf-ID und Probenname. 1 = Dialogfeld „Run ID“ (Testlauf-ID), 2 = Schaltfläche „Import Sample“ (Probe importieren), 3 = Dialogfeld „Sample Name“ (Probenname), 4 = Probenliste, 5 = Fensterabschnitt „Layout of the pipetting adapter“ (Anordnung des Pipettenadapters). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 24 Abbildung 4. Eingabe weiterer Probennamen in das Dialogfeld „Sample Name“ (Probenname). *1 = Schaltfläche „Import Sample“ (Probe importieren), 2 = Dialogfeld „Sample Name“ (Probenname) und Probenliste, 3 = Fensterabschnitt „Layout of the pipetting adapter“ (Anordnung des Pipettenadapters). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 25 Röhrchen gefüllt werden müssen. Stellen Sie sicher, dass alle unbesetzten Rotorpositionen mit verschlossenen, leeren Röhrchen gefüllt sind, und klicken Sie dann auf „OK“, um fortzufahren. Abbildung 5. Dialogfeld „Notes“, die Schaltfläche „Start Run“ und der Warnhinweis über unbesetzte Rotorpositionen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 26 Testlaufdatei in dem ausgewählten Speicherort. Klicken Sie auf „Save“ (Speichern, siehe Abbildung 7). Abbildung 7. Speichern der Testlaufdatei. 1 = Fenster „Save As“ (Speichern unter), 2 = Dateiname und speichern als *.rex-Datei, 3 = „Save“ (Speichern). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 27 19. Der PCR-Testlauf wird gestartet. Hinweis: Beim Start des Testlaufs wird automatisch die Registerkarte „Run Progress“ (Testlauffortschritt) geöffnet, auf der die Temperaturkurve und die verbleibende Testlaufzeit angezeigt werden (siehe Abbildung 8). Abbildung 8. Registerkarte „Run Progress“. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 28 Verdünnen Sie mit nukleasefreiem Wasser zur Verdünnung (Dil.) und wiederholen Sie den Test. Verdünnen Sie auf einen C im Bereich von 21,92 bis 32,00. Durch eine Verdünnung im Verhältnis 1:1 erhöht sich der C -Wert um etwa 1,0. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 29 Schaltfläche „Save As“ (Speichern unter) klicken. Abbildung 10. Auswahl des KRAS-Analyseberichts. 1 = „Report“ (Bericht), 2 = Fenster „Report Browser“ (Berichtsbrowser), 3 = Schaltfläche „KRAS Analysis Report“ (KRAS-Analysebericht), 4 = „Show“ (Anzeigen). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 30: Protokoll: Nachweis Von Kras-Mutationen

    7 Proben zusammengefasst werden, um das therascreen KRAS RGQ PCR Kit effizient zu nutzen. Bei kleineren Chargengrößen wird die Anzahl der Proben, die mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit getestet werden können, verringert. Stellen Sie vor dem ersten Gebrauch des Rotor-Gene Q MDx Instruments ...
  • Seite 31 Kennzeichnungen auf den Deckeln zur richtigen Ausrichtung. Hinweis: Jeder PCR-Testlauf kann maximal 7 Proben umfassen. Wenn nicht alle Positionen des Rotors belegt sind, müssen alle unbesetzten Positionen im Rotor mit jeweils einem verschlossenen, leeren Röhrchen bestückt werden. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 32 Abbildung 12. 1 = Registerkarte „Setup“ (Konfiguration) und 2 = Kontrollkästchen „Locking Ring Attached“ (Schließring angebracht). 13. Geben Sie gemäß der vor Ort üblichen Benennungskonvention die Testlauf- ID in das Dialogfeld „Run ID“ (Lauf-ID) ein. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 33 2 = Schaltfläche „Import Sample“ (Probe importieren) (mit Version 2.1 der Software nicht verfügbar), 3 = Dialogfeld „Sample Name“ (Probenname), 4 = Probenliste, 5 = Fensterabschnitt „Layout of the pipetting adapter“ (Anordnung des Pipettenadapters), 6 = hervorgehobener Probenkreis und darunter hervorgehobene Spalte mit 8 Assays. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 34 Positionen im Rotor mit verschlossenen, leeren Röhrchen gefüllt werden müssen. Stellen Sie sicher, dass alle unbesetzten Rotorpositionen mit verschlossenen, leeren Röhrchen gefüllt sind, und klicken Sie dann auf „OK“, um fortzufahren. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 35 Abbildung 16. Warnhinweis über unbesetzte Rotorpositionen. 17. Das Fenster „Save As“ (Speichern unter) wird angezeigt. Wählen Sie einen geeigneten Dateinamen aus, und speichern Sie den PCR-Testlauf als *.rex- Testlaufdatei an dem ausgewählten Speicherort (siehe Abbildung 17). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 36 Hinweis: Beim Start des Testlaufs wird automatisch die Registerkarte „Run Progress“ (Testlauffortschritt) geöffnet, auf der die Temperaturkurve und die verbleibende Testlaufzeit angezeigt werden (siehe Abbildung 18). Abbildung 18. 1 = Registerkarte „Run Progress“ (Testlauffortschritt). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 37 Status“ (Status der Negativkontrolle) das Ergebnis „Valid“ (Gültig) angezeigt, ansonsten lautet die Anzeige „Invalid“ (Ungültig). Fensterabschnitt „Sample Result Table“ (Tabelle der Probenergebnisse):  Für mutationspositive Proben werden in der Spalte „KRAS Mutation Status“ (KRAS-Mutationsstatus) die jeweiligen Mutationen angegeben. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 38 Speicherort gespeichert werden, indem Sie oben links im jeweiligen Bericht auf „Save As“ (Speichern unter) klicken. Abbildung 20. Auswahl des KRAS-Analyseberichts. 1 = „Report“ (Bericht), 2 = Fenster „Report Browser“ (Berichtsbrowser), 3 = Schaltfläche „KRAS Analysis Report“ (KRAS-Analysebericht), 4 = „Show“ (Anzeigen). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 39: Interpretation Der Ergebnisse

    -Werte können daher eine beliebige reelle Zahl (nicht beschränkt auf ganze Zahlen) über den Bereich von 0 bis 40 annehmen. Der Schwellenwert für das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist auf 0,05 relative Fluoreszenzeinheiten festgelegt. Dieser Wert ist in der therascreen KRAS Assay Package Software für die beiden Fluoreszenzkanäle „Green“...

  • Seite 40: Fehlerbehebung

    „Frequently Asked Questions“ (Häufig gestellte Fragen) unseres Support-Centers unter: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Darüber hinaus steht Ihnen unser QIAGEN Technischer Service unterstützend zur Seite, falls Sie Fragen zum Protokoll oder zu anderen Angaben in diesem Handbuch haben sollten (Kontakt- informationen siehe hintere Umschlagseite oder unter www.qiagen.com). Das Team besteht aus erfahrenen Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern, die Ihnen in allen molekularbiologischen Fragen gerne weiterhelfen.

  • Seite 41: Von Der Therascreen Kras Assay Package Software Angezeigte Markierungen41

    _FAIL FAM-C Testlauf wiederholen. kontrolle in der Kontroll- reaktion außerhalb des zulässigen Bereichs. PC_MUTATION PCR-Testlauf ungültig – Den gesamten PCR- FAM-C für mindestens _ASSAY_FAIL Testlauf wiederholen. eine Mutationskontroll- reaktion außerhalb des zulässigen Bereichs. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 42 Den gesamten PCR-Testlauf _DATA Fluoreszenzdaten der wiederholen. Negativkontrolle können nicht ausgewertet werden. SAMPLE_CTRL Probe ungültig – Neuen PCR-Testlauf _INVALID_DATA Fluoreszenzdaten der einrichten, um die Probenkontrolle können entsprechenden Proben nicht ausgewertet werden. zu wiederholen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 43 Extraktion zu testen. Wenn ungültig, diese zweite Extraktion wiederholen. Wenn die Probe nach diesem Testlauf kein gültiges Ergebnis ergibt, wird der Probe der Mutationsstatus „Unbe- stimmt“ zugewiesenen, und es werden keine weiteren Tests mehr durchgeführt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 44 Extraktion zu testen. Wenn ungültig, diese zweite Extraktion wiederholen. Wenn die Probe nach diesem Testlauf kein gültiges Ergebnis ergibt, wird der Probe der Mutationsstatus „Unbe- stimmt“ zugewiesenen, und es werden keine weiteren Tests mehr durchgeführt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 45 40 µl ist, und diese Verdünnung testen. Wenn die Probe nach diesem Testlauf kein gültiges Ergebnis ergibt, wird der Probe der Mutationsstatus „Unbestimmt“ zugewie- senen, und es werden keine weiteren Tests mehr durchgeführt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 46 Extraktion zu testen. Wenn ungültig, diese zweite Extraktion wiederholen. Wenn die Probe nach diesem Testlauf kein gültiges Ergebnis ergibt, wird der Probe der Mutationsstatus „Unbe- stimmt“ zugewiesenen, und es werden keine weiteren Tests mehr durchgeführt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 47 Extraktion zu testen. Wenn ungültig, diese zweite Extraktion wiederholen. Wenn die Probe nach diesem Testlauf kein gültiges Ergebnis ergibt, wird der Probe der Mutationsstatus „Unbe- stimmt“ zugewiesenen, und es werden keine weiteren Tests mehr durchgeführt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 48 Tests mehr durchgeführt. SAMPLE_POSITIVE Mindestens eine Mutation Keine _AND_INVALID ist für eine Probe gültig und positiv, und gleich- zeitig ist mindestens eine Mutation für dieselbe Probe ungültig (Warn- hinweis, kein Fehler). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 49: Qualitätskontrolle

    Tumoren des Kolorektalkarzinoms (CRC) oder des nichtkleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) validiert. Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist ausschließlich für den Gebrauch mit dem QIAamp DNA FFPE Tissue Kit validiert. Für den Gebrauch mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurde ausschließlich das Rotor-Gene Q MDx Instrument validiert.

  • Seite 50: Leistungsmerkmale

    Leistungsmerkmale Analytische Leistung Die Leistungsmerkmale des therascreen KRAS RGQ PCR Kits wurden in Unter- suchungen an FFPE-Gewebeproben von Patienten mit Kolorektalkarzinom (CRC) oder nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) bestimmt. Die NSCLC- Proben wurden mittels Nadelbiopsie, Feinnadelbiopsie und Exzision gewonnen. Für jeden Probentyp wurden 8 humane FFPE-Zelllinien verwendet, von denen gemäß...
  • Seite 51 KRAS RGQ PCR Kit bestimmte Mutationsstatus von Kolorektal- karzinomproben mit dem der bidirektionalen Sequenzierung übereinstimmt. Für insgesamt 137 FFPE-Proben wurden sowohl für das therascreen KRAS RGQ PCR Kit als auch für die bidirektionale Sequenzierung gültige Ergebnisse erzielt. Die Gesamtergebnisse einschließlich 6 fehlgeschlagener bidirektionaler Sanger- Sequenzierungsproben sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
  • Seite 52 Die Analyse der Übereinstimmung wurde an 247 Proben durchgeführt, für die sowohl Ergebnisse der bidirektionalen Sanger-Sequenzierung als auch des therascreen KRAS RGQ PCR Kits vorlagen. Es gab 9 nicht übereinstimmende Proben. Die Gesamtübereinstimmung betrug 96,4 %. Die Daten belegen die hohe Richtigkeit des therascreen KRAS RGQ PCR Kits (Tabelle 10 und Tabelle 11).
  • Seite 53 Ergebnissen einer bidirektionalen Sanger-Sequenzierung klinischer FFPE-NSCLC- Proben, die durch Exzision, Nadelbiopsie oder Feinnadelbiopsie gewonnen wurden. Vor dem Testen mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurde aus jeder Probe DNA extrahiert. Die Ergebnisse dieses Tests wurden mit denen einer bidirektionalen Sanger-Sequenzierung verglichen.
  • Seite 54 Bei insgesamt 360 Proben wurden sowohl mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit als auch mit der bidirektionalen Sanger-Sequenzierung gültige Ergebnisse erzielt, wobei 340 Proben übereinstimmende Ergebnisse lieferten. Die Übereinstimmung zwischen dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit und der bidirektionalen Sanger-Sequenzierung ist in Tabelle 12 dargestellt. Bei zwei Proben ergab die bidirektionale Sanger-Sequenzierung eine doppelte Mutationsbestimmung.

  • Seite 55: Nachweisgrenze (Lod)

    Negative Übereinstimmung 261/280 (93,21) 90,20–95,51 Nachweisgrenze (LOD) Der Messbereich des therascreen KRAS RGQ PCR Kits basiert auf der Menge an amplifizierbarer DNA in der Probe, die anhand des C -Werts der Kontroll- reaktion bestimmt wird. Der durch den Kontroll-C festgelegte Aufgabebereich des Assays beträgt 21,92 bis 32,00.
  • Seite 56 12SER 12VAL 13ASP NSCLC Die Nachweisgrenze des therascreen KRAS RGQ PCR Kit-Assays wurde unter Verwendung von Kolorektalkarzinom-Gewebe bestimmt und validiert. Diese LOD-Ergebnisse wurden für NSCLC-Gewebe erneut verifiziert. Die Untersuchung bestand aus 2 Teilen. In Teil 1 wurden 60 Replikate von 7 mutierten FFPE-NSCLC-Zelllinien, die jeweils eine Mutation repräsentierten,...

  • Seite 57: Dna-Aufgabe Und Linearität

    -Wert, der von den Ergebnissen erhalten wurde, sind in Tabelle 15 und Tabelle 16 zusammengefasst. Insgesamt waren die ∆C -Werte bei allen Assays über den Messbereich des therascreen KRAS RGQ PCR Kits konsistent, wodurch belegt wurde, dass die DNA-Konzentration keinen Einfluss auf die Genauigkeit der Mutationsbestimmung hat.
  • Seite 58 Für jede Mutationsreaktion wurde die Linearität und Amplifikationseffizienz der PCR relativ zur Kontrollreaktion über den gesamten Messbereich des therascreen KRAS RGQ PCR Kits nachgewiesen. Die Amplifikationseffizienz wurde für die verschiedenen Mutationsreaktionen und die Kontrollreaktion nach der Gleichung [2(–1/Steigung)] –1 berechnet.
  • Seite 59 Begonnen wurde dabei mit einem Aufgabe-C von 22 bis 23. Vor der Durchführung der PCR mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit wurde zunächst die optische Dichte der DNA-Extrakte von den CRC-FFPE-Zelllinien und den NSCLC-Proben gemessen. Dann wurden DNA-Stammlösungen mit einem C der Kontrollreaktion von ungefähr 23 angesetzt.
  • Seite 60 Probe therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 61 Probe therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 62: Störsubstanzen

    Störsubstanzen Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen potenzieller Störsubstanzen auf die Leistung des therascreen KRAS RGQ PCR Kits auszuwerten. Dazu wurden mittels Spiking-Versuchen mit verschiedenen Konzentrationen die Auswirkungen jeder Substanz auf die ∆C -Werte und den Mutationsstatus der Testproben analysiert.

  • Seite 63: Exklusivität/Kreuzreaktivität

    Es wurde der Umfang der nicht spezifischen Amplifikation von Wildtyp-DNA nach Reaktionsgemisch bestimmt, der für die Amplifikation spezifischer Mutationen geeignet ist. Hierzu wurden mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit insgesamt 60 Replikate von Wildtyp-DNA aus FFPE-Zelllinien und 60 Proben, die aus Gewebe des nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom extrahiert wurden, in der höchsten amplifizierbaren DNA-Aufgabekonzentration beurteilt.
  • Seite 64 13,74 † 12VAL N. z. 13,29 13,89 N. z. N. z. 14,36 4,5* 13ASP N. z.: Keine Kreuzreaktion. * ∆C -Werte von passenden Reaktionen. ∆C -Werte von kreuzreaktiven Reaktionen unterhalb des Cut-off-Wertes. † therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 65: Wiederholbarkeit Und Reproduzierbarkeit

    KRAS RGQ PCR Kit getestet. Dabei kamen an jedem der 3 Standorte 2 Bediener zum Einsatz, die sowohl Proben als auch Kontrollen von 3 Chargen des therascreen KRAS RGQ PCR Kits täglich über einen Zeitraum von 5 Tagen testeten. Es wurden pro Tag 2 Testläufe und pro Probe und Tag jeweils 2 Replikate durchgeführt.
  • Seite 66 Die Laborbedingungen an den einzelnen Standorten wurden variiert, indem 2 Rotor-Gene Q MDx Instrumente, 2 Bediener, 2 Chargen des therascreen KRAS RGQ PCR Kits sowie 2 Läufe pro Tag (und Bediener) an 16 nicht aufeinander folgenden Tagen eingesetzt wurden.
  • Seite 67 98,97 13ASP 288/288 98,97 12ALA 288/288 98,97 12ARG 288/288 98,97 12ASP 288/288 98,97 3 × LOD 12CYS 284/288 98,61 96,85 12SER 284/288 98,61 96,85 12VAL 288/288 98,97 13ASP 287/287 98,96 285/285 98,95 Wildtyp therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 68: Variabilität Der Probenhandhabung

    An jedem der 3 Standorte wurde die DNA aus einem Batch von 20 FFPE-Schnitten (10 Paaren) pro Mutation bzw. Wildtyp extrahiert. Bei den Tests der vorbereiteten Proben mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit an den 3 verschiedenen Teststandorten war die Mutationsbestimmung bei allen 7 Mutationen und den Wildtyp-Proben korrekt.

  • Seite 69: Äquivalenz Der Probengewinnungsmethoden (Nur Nsclc)

    Äquivalenz der Probengewinnungsmethoden (nur NSCLC) Mit dieser Untersuchung sollte beurteilt werden, ob die Mutationsbestimmung mit dem therascreen KRAS RGQ PCR Kit bei NSCLC-Proben durch die Methode der Probengewinnung beeinflusst wird. Es wurden die 3 Probengewinnungs- methoden Exzision, Feinnadelbiopsie und Nadelbiopsie untersucht.

  • Seite 70: Literatur

    Bokemeyer, C. et al., (2008) K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J. Clin. Oncol. 26 (May 20 suppl; abstr 4000). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 71 June 27, 2008. Khambata-Ford, S. et al. (2007) Expression of Epiregulin and Amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J. Clin. Oncol. 25, 3230. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 72 Van Cutsem, E. et al. (2008) K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 2). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 73: Symbole

    Verpackung und Etikettierung können die folgenden Symbole enthalten: Kit enthält Reagenzien für <N> Reaktionen <N> Verwendbar bis In-vitro-diagnostisches Medizinprodukt Katalognummer Chargennummer Materialnummer Enthält Anzahl Bevollmächtigter R = Revision des Handbuchs; n = Revisionsnummer Zulässiger Temperaturbereich Hersteller Gebrauchsanleitung beachten Vorsicht therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 74: Kontakt

    Technischen Support-Center unter www.qiagen.com/Support. Telefonisch erreichen Sie uns unter der Rufnummer 00800-22-44-6000. Darüber hinaus ist Ihnen das Team vom Technischen Service gerne behilflich, falls Sie Rat oder weitere Informationen zu QIAGEN Produkten benötigen (Kontaktinformationen siehe hintere Umschlagseite oder unter www.qiagen.com).

  • Seite 75: Anhang 1: Therascreen Kras Rgq Pcr Kit - Manuelles Protokoll

    Anhang 1: therascreen KRAS RGQ PCR Kit – manuelles Protokoll In diesem Abschnitt finden Sie Anleitungen zur Verwendung des therascreen KRAS RGQ PCR Kits mit RGQ Software, Version 2.3, im offenen Modus (d. h. ohne KRAS Assay Package). Allgemeine Informationen Weitere Informationen zu benötigtem Material finden Sie unter „Zusätzlich...
  • Seite 76 Anmerkungen ein und wählen Sie für „Reaction Volume“ (Reaktions- volumen) den Wert 25 aus. Vergewissern Sie sich, dass unter „Sample Layout“ (Probenkonfiguration) „1, 2, 3…“ ausgewählt ist. Klicken Sie auf „Next“ (Weiter) (Abbildung 22). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 77 5. Klicken Sie im Dialogfeld „New Run Wizard“ (Assistent für neue Läufe) auf „Edit Profile“ (Profil bearbeiten) (Abbildung 23) und programmieren Sie gemäß den Informationen in den folgenden Schritten das Temperaturprofil. Abbildung 23. Bearbeiten des Profils. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 78 „Insert after“ (Einfügen nach) und wählen Sie „New Cycling“ (Neuer Zyklus) (Abbildung 25). Abbildung 25. Erster Inkubationsschritt bei 95 °C. 1 = „Hold Temperature“ (Temperatur halten) und „Hold Time“ (Zeit halten), 2 = „Insert after“ (Einfügen nach), 3 = „New Cycling“ (Neuer Zyklus). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 79 Schritt aus und stellen Sie diesen auf „95°C for 30 secs“ (95 °C für 30 Sek.) ein (Abbildung 26). Abbildung 26. Zyklusschritt bei 95 °C. 1 = Anzahl der Zykluswiederholungen, 2 = Temperatureinstellung für ersten Schritt, 3 = Zeiteinstellung für ersten Schritt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 80 60 secs“ (60 °C für 60 Sek.) ein. Aktivieren Sie durch Klicken auf „Not Acquiring“ (Keine Erfassung) die Datenerfassung für diesen Schritt (Abbildung 27). Abbildung 27. Zyklusschritt bei 60 °C. 1 = Temperatur- und Zeiteinstellung für zweiten Schritt, 2 = „Not Acquiring“ (Keine Erfassung). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 81 Wählen Sie „Green“ (Grün) und „Yellow“ (Gelb) als zu erfassende Kanäle aus, indem Sie auf „>“ klicken, um diese Kanäle in die Liste „Available Channels“ (Verfügbare Kanäle) zu verschieben. Klicken Sie auf „OK“ (Abbildung 28). Abbildung 28. Erfassung im Zyklusschritt bei 60 °C. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 82 10. Markieren Sie den dritten Schritt und löschen Sie diesen, indem Sie auf „–“ klicken. Klicken Sie auf „OK“ (Abbildung 29). Abbildung 29. Entfernen des Erweiterungsschrittes. 11. Klicken Sie im nächsten Dialogfeld auf „Gain Optimisation“ (Verstärkungsoptimierung) (Abbildung 30). Abbildung 30. Verstärkungsoptimierung. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 83 12. Klicken Sie auf „Optimise Acquiring“ (Erfassung optimieren). Es werden für jeden Kanal die Kanaleinstellungen angezeigt. Bestätigen Sie diese Standardwerte, indem Sie für beide Kanäle auf „OK“ klicken (Abbildung 31). Abbildung 31. Automatische Verstärkungsoptimierung für den grünen Kanal. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 84 Sie dann auf „Close“ (Schließen), um zum Assistenten zurückzukehren (Abbildung 32). Abbildung 32. Auswahl des grünen und gelben Kanals. 14. Klicken Sie auf „Next“ (Weiter), um die Vorlage am gewünschten Speicherort zu speichern. Klicken Sie dazu auf „Save Template“ (Vorlage speichern). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 85 Protokoll: therascreen KRAS PCR RGQ Setup 1. Öffnen Sie die Rotor-Gene Q Software 2.3 und rufen Sie das gewünschte Temperaturprofil auf. Erstellen Sie das Temperaturprofil gemäß der Anleitung unter„Protokoll: Erstellen eines Temperaturprofils“ auf Seite 75. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 86 Klicken Sie auf „Next“ (Weiter) (Abbildung 33). Abbildung 33. Dialogfeld „New Run Wizard“ (Assistent für neue Läufe) mit Willkommens- fenster. 1 = „Rotor Type“ (Rotortyp), 2 = „Locking Ring Attached“ (Schließring angebracht), 3 = „Next“ (Weiter). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 87 „1, 2, 3…“ angezeigt wird. Klicken Sie auf „Next“ (Weiter) (Abbildung 34). Abbildung 34. Dialogfeld „New Run Wizard“ (Assistent für neue Läufe). 1 = Felder „Operator“ (Bediener) und „Notes“ (Notizen), 2 = Felder „Reaction Volume“ (Reaktionsvolumen) und „Sample Layout“ (Probenkonfiguration), 3 = „Next“ (Weiter). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 88 Temperaturprofils“ auf Seite 75 erstellt wurde, ist eine Bearbeitung nicht notwendig. Klicken Sie auf „Next“ (Weiter) (Abbildung 35). Abbildung 35. Temperaturbearbeitungsfenster des Dialogfelds „New Run Wizard“ (Assistent für neue Läufe). 1 = „Next“ (Weiter). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 89 Daten aus der Probenbestimmung“ auf Seite 91 oder „Analyse des KRAS- Mutationsnachweises“ auf Seite 92 beschrieben. 8. Falls Quantifizierungsberichte erforderlich sind, klicken Sie in der Symbolleiste der Rotor-Gene Q Laufdatei auf das Berichtssymbol. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 90: Interpretation Der Ergebnisse (Manuell)

    12. KKlicken Sie auf „Outlier Removal“ (Ausreißer entfernen) und geben Sie für „NTC Threshold“ (NTC-Schwellenwert) „10%“ ein. -Werte 13. Stellen Sie den Schwellenwert auf 0,05 ein und überprüfen Sie die C für FAM. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 91: Analyse Der Daten Aus Der Probenbestimmung

    (nukleasefreies Wasser zur Verdünnung, Dil.). -Wert des Proben-Kontroll-Assays > 32: Es wird eine erneute Extraktion  der Probe empfohlen, da eine unzureichende Menge DNA-Starttemplate vorhanden ist, um alle Mutationen an den für den Assay angegebenen Cut-off-Werten nachzuweisen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 92: Analyse Des Kras-Mutationsnachweises

    Werten. Ein Wert außerhalb dieses Bereichs zeigt einen Fehler bei der Assaykonfiguration an; der Lauf wird daher als fehlgeschlagen gewertet. Hinweis: Die Probendaten dürfen nicht verwendet werden, wenn eine dieser beiden Laufkontrollen fehlgeschlagen ist. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 93 -Röhrchen im Bereich kontrolle OK 23,5–29,5? Liegt 12VAL-FAM- NEIN LAUF FEHLG. -Röhrchen im Bereich 23,5–29,5? NEIN LAUF FEHLG. Positiv- Mit Probenanalyse fortfahren kontrolle OK (Seite 94) Abbildung 37. Flussdiagramm zur Analyse der Laufkontrollen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 94: Probenanalyse

    -Wert um 1 erhöht. Die Proben sind mit dem im Kit enthal- tenen Wasser zu verdünnen (nukleasefreies Wasser zur Verdünnung, Dil.). -Wert des Proben-Kontrollassays > 32: Das Ergebnis sollte mit Vorsicht  interpretiert werden, da besonders niedriggradige Mutationen möglicher- weise nicht erkannt werden. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 95 -Bereich für den As say nach gewiesen (pos itive Amp lifikatio n)? KRAS-Mutation für den KRAS Mutation Detected Mutationsassay mit dem for mutation assay with smallest ∆C kleinsten ∆C nachgewiesen Abbildung 38. Flussdiagramm der Probenanalyse. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 96 ≤ 6,60 12ARG 0,00–40,00 ≤ 8,00 12CYS 0,00–40,00 ≤ 8,00 12SER 0,00–40,00 ≤ 8,00 12VAL 0,00–40,00 ≤ 7,50 13ASP 0,00–40,00 ≤ 7,50 * Die Grenzwerte der angegebenen Bereiche gehören noch zu den zulässigen Werten. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 97 Die FAM-Amplifikation ist negativ und die HEX-Amplifikation ist negativ.  Wenn die HEX-Amplifikation einer Probe in einem Röhrchen negativ ist, die FAM-Amplifikation in einem anderen Röhrchen aber positiv ist, kann das Ergebnis „Mutation nachgewiesen“ in dem anderen Röhrchen zwar als gültig therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 98 Ungültig: Keine der Mutationsreaktionen ist positiv und mindestens eine  Mutationsreaktion ist ungültig. Hinweis: Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist für den Nachweis von Mutationen im KRAS-Gen einer DNA-Probe vorgesehen. Wenn eine Probe als „KRAS-Mutation nachgewiesen“ eingestuft wird, ist nur eine bestimmte Mutation anzugeben.

  • Seite 99: Anhang 2: Installation Der Therascreen Kras Assay Package Software

    Anhang 2: Installation der therascreen KRAS Assay Package Software Das therascreen KRAS RGQ PCR Kit ist für den Gebrauch mit dem Rotor- Gene Q MDx mit einem 72-Well-Rotor bestimmt. Die therascreen KRAS Assay Package Software ist separat auf CD erhältlich (Katalog-Nr. 9022641).
  • Seite 100 3. Starten Sie die Installation, indem Sie auf die Datei therascreen_KRAS_Assay_Package_3.1.1.exe ODER therascreen_KRAS_Assay_Package_1.0.12.exe doppelklicken. 4. Der Einrichtungsassistent wird angezeigt. Klicken Sie auf „Next“ (Weiter), um fortzufahren (Abbildung 39). Abbildung 39. Das Dialogfeld „Setup“ (Konfiguration). 1 = „Next“ (Weiter). therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 101 Abbildung 41. Schließen des Einrichtungsassistenten. 7. Starten Sie den Computer neu. Es werden automatisch Verknüpfungen zu den Vorlagen „therascreen KRAS QC Locked Template“ und „therascreen KRAS Locked Template“ erstellt und auf dem Desktop angezeigt. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 102: Bestellinformationen

    72 × 0.1 ml Tubes Reaktionseinrichtung mit einer Einkanalpipette in 72 × 0,1-ml- Röhrchen Strip Tubes and Caps, 250 Streifen mit jeweils 4 Röhrchen 981103 0.1 ml (250) und Deckeln für 1.000 Reaktionen therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...

  • Seite 103: Bearbeitungshistorie

    Säulen, Proteinase K, Puffer, Entnahmeröhrchen (2 ml) Aktuelle Lizenzinformationen und produktspezifische Anwendungseinschrän- kungen finden Sie im jeweiligen QIAGEN Kit- oder Geräte-Handbuch. Diese stehen unter www.qiagen.com zur Verfügung oder können vom QIAGEN Technischen Service oder dem für Sie zuständigen Außendienstmitarbeiter oder Distributor angefordert werden.
  • Seite 104 Diese Seite wurde absichtlich leer gelassen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
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  • Seite 106 Diese Seite wurde absichtlich leer gelassen. therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbuch 01/2019...
  • Seite 107 Einige dieser zusätzlichen Protokolle wurden von QIAGEN Anwendern für andere QIAGEN Anwender zur Verfügung gestellt. Diese Protokolle wurden von QIAGEN nicht eingehend geprüft oder optimiert. QIAGEN übernimmt für diese Protokolle keine Garantie und garantiert auch nicht, dass sie keine Rechte Dritter verletzen.
  • Seite 108 Bestellungen www.qiagen.com/contact | Technischer Support support.qiagen.com | Website www.qiagen.com Sample & Assay Technologies 1116068DE 01/2019...

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