MACHEREY-NAGEL NUCLEOSIL CHIRAL-2 Kurzanleitung

NUCLEOSIL
Bitte beachten:
Allen HPLC-Säulen von MACHEREY-NAGEL liegt ein Zertifikat bei, dem spezifische Daten und Testergebnisse
der Säule entnommen werden können. Mit jeder NUCLEOSIL
haben Sie ein Qualitätsprodukt auf Basis des bewährten, robusten Kieselgels NUCLEOSIL
als chiraler Selektor die D- bzw. L-Form von N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-phenylglycin kovalent gebunden wurde und
das speziell für den Einsatz in der chromatographischen Hochleistungsanalytik für die Enantiomerentrennung
entwickelt wurde. Bei sorgfältiger und sachgerechter Verwendung können beste Trennresultate und eine lange
Lebensdauer erzielt werden. Dieses Produkt kann zur Trennung zahlreicher Gemische und zur quantitativen
Bestimmung der darin enthaltenen Komponenten eingesetzt werden. Alle HPLC-Trennsäulen sind gemäß den
allgemeingütigen Prinzipien und Arbeitstechniken der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zu verwenden.
Der korrekte Ablauf der analytischen Methodik und insbesondere die Prüfung der Leistungsfähigkeit des kom-
pletten Analysensystems, also Trennsäule und HPLC-Anlage sowie die Anpassung der Analysenbedingungen
an die Erfordernisse der jeweiligen Aufgabenstellung liegt in der Verantwortung des Kunden und ist durch den
jeweiligen Anwender sicherzustellen.
MACHEREY-NAGEL übernimmt keine Garantie oder Gewährleistung für die erfolgreiche Durchführung von Ap-
plikationen oder Trennungen. Falls Sie nach dem Lesen dieser Anleitung noch Fragen haben sollten wenden Sie
sich bitte an unseren Service / technische Produktberatung.
Inhaltsübersicht
· Sicherheitshinweise · Eluent
· Beschreibung der Säulen · Flussrate und Druck
· Installation · Temperatur
· Vorsäulenfilter und Vorsäulen · Detektion
· Probe · Equilibrierung
Sicherheitshinweise
Beachten Sie die allgemeinen Gefahrenhinweise für die jeweiligen Mobilphasensysteme (z. B. Acetonitril oder
Methanol) und treffen Sie beim Arbeiten entsprechende Schutzmaßnahmen, z. B. Augenschutz gegen austreten-
de Flüssigkeiten bei plötzlichem Bruch von Kapillarverbindungen. Bitte führen Sie verbrauchte HPLC-Säulen ge-
mäß den landesspezifischen Umweltrichtlinien einer fachgerechten Entsorgung zu. Gewährleisten Sie, dass die
Trennsäulen nur von dem dafür zuständigen Fachpersonal eingesetzt werden. Lassen Sie HPLC-Säulen nicht in
die Hände von Kindern gelangen. Jegliche Garantie oder Gewährleistung von MACHEREY-NAGEL erlischt, falls
durch unsachgemäße Verwendung oder Behandlung (insbesondere das Öffnen der Säule und Freilegen des
Säulenbettes) Folgeschäden auftreten.
Beschreibung der Säulen
Die Säulen NUCLEOSIL ® CHIRAL-2 und CHIRAL-3 wurden zur Kontrolle der optischen Reinheit von Verbindun-
gen unter Normalphasenbedingungen entwickelt. Sie finden vielfältigen Einsatz bei der Analyse von Stereoiso-
meren (Enantiomeren und Diastereomeren), zur Kontrolle der optischen Reinheit (z. B. Pflanzenschutzmittel,
Pharmaka) und zur Prozess- und Produktkontrolle bei chiralen organischen Synthesen. Als chiraler Selektor
wird N-(3,5-Dinitrobenzoyl)-phenylglycin kovalent an NUCLEOSIL
unterscheiden sich nur in der Konfiguration des Chiralitätszentrums. CHIRAL-2 und CHIRAL-3 zeigen daher für
ein Enantiomerenpaar gleiche Selektivität und chromatographische Auflösung, aber eine umgekehrte Elutions-
reihenfolge der optischen Antipoden. Bei der Kontrolle der optischen Reinheit kann der Anwender somit durch
entsprechende Wahl der Phase die Minderkomponente vor dem Produkt eluieren. Peaküberlagerungen werden
dadurch vermieden.
Installation
Der Einbau der HPLC-Säulen sollte unter Berücksichtigung der Flussrichtung, die auf dem Säulenetikett ver-
merkt ist, erfolgen. Sie werden mit gerätetypischen 1/16" Kapillaren und Verschraubungen angeschlossen.
Vorsäulenfilter und Vorsäulen
Zwischen Probeninjektor und Säule ist ein Vorsäulenfilter mit 0,5–2,0 μm porösen Edelstahlfritten empfehlens-
wert, um mögliche Partikel aus dem Eluentenstrom zu entfernen. Zum Schutz und zur Verlängerung der Lebens-
dauer der Säule sollten immer Vorsäulen verwendet werden. Die Filterelemente und das Sorbens der Vorsäule
halten Verunreinigungen aus der Probe oder dem Eluenten zurück. Der Anschluss der Vorsäule an die Trennsäu-
le erfolgt mittels Vorsäulenhalter (siehe hierzu www.mn-net.com oder MN Chromatographie-Katalog). Ein Wech-
sel der Vorsäule ist erforderlich, sobald eine Erhöhung des Säulendruckes und / oder eine Verschlechterung der
Trennleistung beobachtet wird.
Probe
Die Probe wird in der Regel im Eluenten gelöst und vor der Aufgabe auf die Säule durch die Verwendung eines
Spritzenvorsatzfilters (z. B. CHROMAFIL ® Xtra PET, 0,45 μm, 25 mm, REF 729220) gereinigt. Falls trotz Filtration
noch trübe Lösungen in die Säule injiziert werden, kann das die Lebensdauer der Säule beträchtlich verkürzen.
Das Probenvolumen sollte für eine optimale Auflösung möglichst klein gewählt werden und 50 μL nicht über-
schreiten.
Eluent
Die Säulen werden im Normalphasen-Betrieb eingesetzt und daher mit einem Eluenten von n-Heptan – 2-Pro-
panol – Trifluoressigsäure (100:0,05:0,05, v/v/v) ausgeliefert. Zur Trennung von Racematen werden unpolare or-
ganische Eluenten (n-Heptan, i-Octan) empfohlen. Die Retentionszeit kann durch Zusatz von polaren Verbindun-
gen beeinflusst werden (z. B. Tetrahydrofuran, Alkohole, chlorierte Kohlenwasserstoffe u.ä.). Geringe Mengen
einer starken Säure wie Trifluoressigsäure in dem Eluenten (bis 0,1 vol %) kann die Trennung der Enantiomeren
wesentlich verbessern. Es sollte die pH-Stabilität von 2–8 beachtet werden. Auch Spuren von Wasser sollten
vermieden werden. Es ist empfehlenswert die Eluenten durch eine 0,2–0,45 μm Membran zu filtrieren und zu
entgasen.
Flussrate und Druck
Die Flussrate (empfohlen: 0,5–1,0 mL/min) beeinflußt den Zeitaufwand der Trennung, die Auflösung und die
Lebensdauer der Säule. Sie ist durch den Rückdruck begrenzt, der einen Wert von 400 bar nicht überschreiten
sollte. Wenn bei der Benutzung der Säule unter normalen Flussraten ein erhöhter Rückdruck resultiert, deutet
dieses im Allgemeinen auf eine Verunreinigung des Packungsmaterials hin, die entfernt werden muss (siehe
Behebung möglicher Fehler).
Temperatur
Temperaturen bis zu 60 °C sind für den Betrieb der Säulen geeignet. Sie sollten allerdings mindestens 30 °C
unter dem Siedepunkt des Eluenten liegen, damit eine einwandfreie Detektion gewährleistet ist. Durch Variation
dieser Größe wird die Retentionszeit und insbesondere die Peakform beeinflusst. Die optimalen Temperaturen
für erfolgreiche Trennungen müssen daher empirisch ermittelt werden.
Detektion
®
Mit den NUCLEOSIL CHIRAL-2 und CHIRAL-3 Säulen können spektralphotometrische, refraktometrische
und elektrochemische Detektoren benutzt werden. Bei der Verwendung elektrochemischer Detektoren muss
berücksichtigt werden, dass einige Arbeitselektroden keine erhöhten Temperaturen erlauben. Falls eine höhere
Empfindlichkeit erforderlich ist, können Nachsäulenderivatisierungen mit einem geeigneten Detektor für die Re-
aktionsprodukte eingesetzt werden.
Equilibrierung
Bevor Proben gemessen werden können, muss die Säule mit dem Eluenten bei gleicher Flussrate und Tempe-
ratur der anzuwendenden Methode gespült werden. Die Säule ist equilibriert, wenn die Basislinie des Detektors
keine Drift mehr aufweist.
Säulenaufbewahrung
Für die Aufbewahrung wird der ursprüngliche Eluent (s. Eluent) empfohlen. Verwenden Sie für die Langzeitla-
gerung keine mobilen Phasen, die anorganische Salze enthalten. Stellen Sie bitte sicher, dass die Verschluss-
schrauben fest schließen, da ansonsten das Packungsmaterial austrocknen kann.
Anwendungsbeispiel
Kontrolle der optischen Reinheit von
Mecoprop-Methyl
Probe: Mecoprop-Methyl 90 % ee
®
Säule: a) EC 250/4 NUCLEOSIL CHIRAL-2
REF 720088.40
®
b) EC 250/4 NUCLEOSIL CHIRAL-3
REF 720350.40
Eluent: n-Heptan – 2-Propanol – TFA
(100:0,05:0,05, v/v/v)
Flussrate: 1 mL/min
Temperatur: RT
Detektion:
UV, 230 nm
Injektion: 1 μL
MN Appl. Nr. 111360
Deutschland und International:
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Valencienner Str. 11 · 52355 Düren · Deutschland
Tel.: +49 24 21 969-0
info@mn-net.com · www.mn-net.com
®
CHIRAL-2 / CHIRAL-3
® ®
CHIRAL-2 und NUCLEOSIL CHIRAL-3 Säule
® erworben, an das
· Säulenaufbewahrung
· Anwendungsbeispiel
· Behebung möglicher Fehler
· Säulenregenerierung
· Zusammenfassung
® Kieselgel gebunden. Die beiden Sorbentien
a) b)
95 % D 95 % D
5 % L
5 % L
0 10 min 0
Schweiz:
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Schweiz
Tel.: +41 62 388 55 00
sales-ch@mn-net.com
Behebung möglicher Fehler
Das folgende Schema beschreibt typische Symptome eines Leistungsverlustes und deren Ursache. Alle Säulen
unterliegen den strengen Richtlinien und Kontrollen unserer Qualitätssicherung. Säulen auf Kieselgelbasis sind
naturgemäß sehr robust und halten bei korrekter Pflege und Behandlung ihre Trennleistung über lange Zeiträume
aufrecht. Erfahrungsgemäß sind Säulenausfälle meist auf eine Verunreinigung des Sorbensbettes zurückzufüh-
ren. Verwendung einer Vorsäule sowie sachgerechte Probenvorbehandlung verhindern meist diese Probleme. Alle
®
NUCLEOSIL CHIRAL-2 und alle NUCLEOSIL
und mit einem Testchromatogramm ausgeliefert, das die Trennleistung der betreffenden Säule dokumentiert.
Benutzen Sie folgendes Schema, um die Ursache eines möglichen Leistungsabfalls zu ermitteln:
Symptom / Fehler / Ursache
Basislinien-Drift
· nicht ausreichende Zeit zur Gleichgewichtseinstel-
lung mit dem Eluenten
· verunreinigter Eluent
· Temperatur
Breite Peaks
· Mischung und / oder Diffusion vor / hinter der Säule
· zu großes Probenvolumen
Peaküberlagerung; zu schnelle Elution
zu schnelle Elution und / oder unzureichende
Trennung durch:
· nicht angemessene Säulentemperatur oder
Eluentenflussrate
· Elutionskraft des Eluernten zu hoch
Steigender Rückdruck; Verschlechterung der
Trennung
Verunreinigung des Sorbens durch:
· Ansammlung von Partikeln auf der Fritte oder im
Sorbensbett aus der Probe, dem Eluenten oder
dem System
Unzureichende Trennung; Verschlechterung der
Trennung bei normalem Säulendruck
Verunreinigung mit:
· Fette, Öle, Lipide aus der Probe (Belegung der
Sorbensoberfläche) und andere organische Sub-
stanzen aus unsachgemäß aufbereiteten Eluenten
und Matrices
Doppelpeaks (Totvolumen)
· fehlerhafte Verschraubungen (Kapillaren, Ferrules,
Schrauben)
· Kompression des Säulenbettes durch zu hohe
Flussraten für den Eluenten
· Auflösung des Kieselgels durch zu hohen pH-Wert
des Eluenten
Säulenregenerierung
In einigen Fällen kann die Trennleistung der Säule wiederhergestellt werden, indem man die Verunreinigungen
vom Sorbensbett entfernt. Allerdings ist es wichtig, die Ursache der Verunreinigung zu lokalisieren, bevor die
Säule wieder für die Analyse von Proben verwendet wird.
1. Frischen Eluenten zubereiten: In einigen Fällen wird der Leistungsabfall durch eine Verunreinigung des Elu-
enten verursacht. Verwenden Sie deshalb stets frischen Eluenten und spülen Sie alle Flüssigkeitsleitungen,
bevor Sie die Säule weiter benutzen. Der Eluent sollte vor Gebrauch durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert
und entgast werden.
2. Reinigen des Sorbens: Zur Entfernung von Verunreinigungen werden 50 mL 2-Propanol mit einem Fluss
von 0,1 mL/min durch die umgedrehte Säule gepumpt. Danach kehren Sie zum Ausgangseluenten mit der
ursprünglichen Flussrichtung zurück.
3. Regenerierung: Durch Spülen der Säule mit n-Heptan – 2-Propanol – Trifluoressigsäure (100:0,05:0,05, v/v/v)
bei einer Flussrate von 0,2 mL/min kann die Phase regeneriert werden.
4. Säulenaustausch: Die hier beschriebenen Vorschläge können die Trennleistung der Säule leider nicht in al-
len Fällen wieder herstellen. Bestimmte organische Verunreinigungen lassen sich durch die beschriebenen
Reinigungsmethoden nicht immer entfernen, so dass die Säule ausgewechselt werden muss. Wir empfehlen
dringend, die Ursache des Problems zu ermitteln, bevor Sie eine neue Säule einsetzen.
Zusammenfassung
Um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, berücksichtigen Sie bitte folgende Hinweise:
1. Als Eluenten werden unpolare organische Eluenten (n-Heptan, i-Octan) empfohlen. Polare Zusätze
(z. B. Tetrahydrofuran, Alkohole, chlorierte Kohlenwasserstoffe u.ä.) und geringe Mengen an Säuren (z. B. Trif-
luoressigsäure) können beigegeben werden. Die Eluenten sollten durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert
und entgast werden.
2. Filtrieren Sie die Proben vor der lnjektion mit einem 0,2–0,45 μm CHROMAFIL
filter.
3. Verwenden Sie zum Schutz von Verschmutzungen einen In-Line-Filter und / oder eine Vorsäule.
4. Die empfohlene Flussrate beträgt 0,5–1,0 mL/min.
5. Stellen Sie die Flussrate so ein, dass der Säulendruck unter 400 bar bleibt.
6. Lagern Sie die Säule in n-Heptan – 2-Propanol – Trifluoressigsäure (100:0,05:0,05, v/v/v).
7. Benutzen Sie für alle Arbeiten Reagenzien mindestens von p.A. Qualität und Lösungsmittel in HPLC-Qualität.
Verwerfen Sie alle Lösungen, die Anzeichen von Bakterienwachstum zeigen.
Informieren Sie sich über alle MACHEREY-NAGEL Chromatographie-Produkte: www.mn-net.com/chromatographie
HPLC GC DC
SPE und Flash Spritzenfilter
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Siret 379 859 531 00020 · RCS Strasbourg B379859531 ·
N° intracommunautaire FR04 379 859 531
www.mn-net.com
®
CHIRAL-3 Säulen werden vor dem Versand sorgfältig getestet
Vorbeugung / Behebung
längeres bzw. besseres Equilibrieren
frische Lösemittel und Reagenzien verwenden
Säulenthermostatisierung
Länge und ID der Kapillaren möglichst klein halten
geringes Injektionsvolumen
entsprechenden Parameter optimieren
Eluentensystem optimieren
Eluenten frisch zubereiten, Proben und Eluenten
vorher filtrieren, In-Line-Filter verwenden / LC-System
spülen, Sorbens reinigen (s.Säulenregenerierung)
organische Substanzen durch Probenvorbereitung
entfernen / Sorbens reinigen (s.Säulenregenerierung)
„PEEK Fingertight Fittings" verwenden, REF 718770
oder REF 718778 / Verschraubungen austauschen
maximale Flussrate und zulässige Eluenten
beachten / Säule austauschen
pH-Stabilität der Säule beachten /
Säule austauschen
®
Xtra PET Spritzenvorsatz-
USA:
MACHEREY-NAGEL Inc.
924 Marcon Blvd., Suite 102 · Allentown, PA 18109 · USA
Tel.: +1 888 321 62 24 gebührenfrei
sales-us@mn-net.com