MACHEREY-NAGEL NUCLEODUR C18 PAH Kurzanleitung

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NUCLEODUR C
18
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NUCLEOSIL C
18
Bitte beachten: Allen HPLC-Säulen von MACHEREY-NAGEL liegt ein Zertifikat bei, dem spezifische Daten
und Testergebnisse der Säule entnommen werden können. Mit der Säule NUCLEODUR
ein Qualitätsprodukt auf Basis des hochreinen und sehr druckstabilen Kieselgels NUCLEODUR
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NUCLEOSIL C PAH basiert auf dem bewährten, robusten Kieselgel NUCLEOSIL
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ziell für den Einsatz in der chromatographischen Hochleistungsanalytik entwickelt worden. Bei sorgfältiger und
sachgerechter Verwendung können beste Trennresultate und eine lange Lebensdauer erzielt werden. Die Säu-
len können zur Trennung von Gemischen polyzyklischer aromtischer Kohlenwasserstoffe (PAK oder engl. PAH)
und zu ihrer quantitativen Bestimmung eingesetzt werden. Alle HPLC-Trennsäulen sind gemäß den allgemein-
gültigen Prinzipien und Arbeitstechniken der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zu verwenden. Der kor-
rekte Ablauf der analytischen Methodik und insbesondere die Prüfung der Leistungsfähigkeit des kompletten
Analysen systems, also Trennsäule und HPLC-Anlage sowie die Anpassung der Analysenbedingungen an die
Erfordernisse der jeweiligen Aufgabenstellung liegt in der Verantwortung des Kunden und ist durch den jeweili-
gen Anwender sicherzustellen. MACHEREY-NAGEL übernimmt keine Garantie oder Gewährleistung für die er-
folgreiche Durchführung von Applikationen oder Trennungen. Falls Sie nach dem Lesen dieser Anleitung noch
Fragen haben sollten, wenden Sie sich bitte an unseren Service / technische Produktberatung.
Inhaltsübersicht
· Sicherheitshinweise · Eluent
· Beschreibung der Säulen · Flussrate und Druck
· Installation · Temperatur
· Vorsäulen · Detektion
· Probe · Equilibrierung
Sicherheitshinweise
Beachten Sie die allgemeinen Gefahrenhinweise für die jeweiligen Mobilphasensysteme (z. B. Acetonitril oder
Methanol) und treffen Sie beim Arbeiten entsprechende Schutzmaßnahmen, z. B. Augenschutz gegen austreten-
de Flüssigkeiten bei plötzlichem Bruch von Kapillarverbindungen. Bitte führen Sie verbrauchte HPLC-Säulen ge-
mäß den landesspezifischen Umweltrichtlinien einer fachgerechten Entsorgung zu. Gewährleisten Sie, dass die
Trennsäulen nur von dem dafür zuständigen Fachpersonal eingesetzt werden. Lassen Sie HPLC-Säulen nicht in
die Hände von Kindern gelangen. Jegliche Garantie oder Gewährleistung von MACHEREY-NAGEL erlischt, falls
durch unsachgemäße Verwendung oder Behandlung (insbesondere das Öffnen der Säule und Freilegen des
Säulenbettes) Folgeschäden auftreten.
Beschreibung der Säulen
Als stationäre Phase enthalten die NUCLEODUR
ente PAH-Analytik auf Basis von voll synthetischem, sphärischem Kieselgel (Typ B); die NUCLEOSIL
Säulen auf Basis von sphärischem Kieselgel (Typ A). Die Säulen werden für eine Gradiententrennung der 16
PAHs nach EPA empfohlen. Darüber hinaus können auch Trennungen weiterer PAH-Substanzen wie beispiels-
weise PAHs nach EFSA durchgeführt werden. Eine umfangreiche Sammlung von PAH-Applikationen finden Sie
in der MN Applikationsdatenbank (www.mn-net.com/apps).
Analyse der 16 PAHs nach EPA
Säule: EC 100/4 NUCLEODUR ® C PAH, 3 μm
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Eluent: A) Methanol – Wasser (80:20, v/v)
B) Acetonitril
Gradient: 2–20 % B in 1,2 min, 20–100 % B in 0,5 min,
100 % B für 2,5 min, 100–2 % B in 0,4 min
Flussrate: 2,5 mL/min
Temp.: 35 °C
Detektion: UV, 254 nm (I), Fluoreszenz (II)
Peaks:
1. Naphthalin 9. Benz[a]anthracen
2. Acenaphthylen* 10. Chrysen
3. Acenaphthen 11. Benzo[b]fluoranthen
4. Fluoren 12. Benzo[k]fluoranthen
5. Phenantren 13. Benzo[a]pyren
6. Anthracen 14. Dibenz[ah]anthracen
7. Fluoranthen 15. Benzo[ghi]perylen
8. Pyren 16. Indeno[1,2,3-cd]pyren
* mit Fluoreszenz nicht nachweisbar
MN Appl. Nr. 123820
Installation
Der Einbau der HPLC-Säulen sollte unter Berücksichtigung der Flussrichtung, die auf dem Säulenetikett ver-
merkt ist, erfolgen. Sie werden mit gerätetypischen 1/16" Kapillaren und Verschraubungen angeschlossen.
Vorsäulen
Zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der Säule, insbesondere bei matrixbelasteten Proben (z. B.
Boden, Öl, Lebensmittel), sollten Vorsäulen verwendet werden. Die Filterelemente und das Sorbens der Vorsäule
halten Verunreinigungen aus der Probe oder dem Eluenten zurück. Der Anschluss der Vorsäule an die Trennsäu-
le erfolgt mittels Vorsäulenhalter (siehe hierzu www.mn-net.com oder MN Chromatographie-Katalog). Ein Wech-
sel der Vorsäule ist erforderlich, sobald eine Erhöhung des Säulendruckes und / oder eine Verschlechterung der
Trennleistung beobachtet wird.
Probe
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe müssen in den verschiedensten Matrizes (z. B. Wasser, Boden,
Öl) bestimmt werden. Daher ist eine effektive Probenvorbereitung notwendig. Hier hat sich in den letzten Jahren
die Festphasenextraktion (SPE) durchgesetzt (SPE-Applikationen, siehe www.mn-net.com/apps). Die vorbe-
reitete Probe wird in Acetonitril oder Methanol aufgenommen. Apolare Lösemittelreste in der Probe sollten ent-
fernt werden, da sie sich nachteilig auf die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten auswirken. Vor der Injektion
sollte die Probe durch Verwendung eines Spritzenvorsatzfilters (z. B. CHROMAFIL
REF 729220) gereinigt werden. Falls trotz Filtration noch trübe Lösungen in die Säule injiziert werden, kann das
die Lebensdauer der Säule beträchtlich verkürzen. Das Probenvolumen sollte für eine optimale Auflösung mög-
lichst klein gewählt werden.
Eluent
Die PAH-Säulen werden mit dem Eluenten Acetonitril – Wasser (70:30, v/v) ausgeliefert. Als Eluenten werden
in der Regel Acetonitril oder Methanol mit reinem Wasser verwendet. Auch kann Tetrahydrofuran als Eluenten-
zusatz verwendet werden. Puffer können, werden aber in der PAH-Analytik normalerweise nicht eingesetzt. Die
pH-Stabilität der Säule von 2–8 sollte beachtet werden. Ein pufferhaltiger Eluent muss stets nach Abschluss von
Messungen durch Spülen der Säule mit mind. 10 Säulenvolumina Acetonitril – Wasser oder Methanol – Was-
ser (10:90, v/v) entfernt werden. Die Eluenten sollten durch einen 0,2–0,45 μm Membranfilter filtriert und ent-
gast werden.
Flussrate und Druck
Die Flussrate (empfohlen für analytische Säulen mit 2–4,6 mm ID: 0,2–2,0 mL/min) beeinflusst den Zeitaufwand
der Trennung, die Auflösung und die Lebensdauer der Säule. Sie ist durch den Rückdruck begrenzt, der den Ma-
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ximalwert von 600 bar (NUCLEODUR ) / 400 bar (NUCLEOSIL
Gemische durchlaufen bei ca. 40 % Methanolanteil ein Viskositätsmaximum. Änderungen der Eluentenzusam-
mensetzung sollten daher bei niedriger Flussrate durchgeführt werden. Wir empfehlen den Rückdruck regelmä-
ßig zu überprüfen. Wenn bei der Benutzung der Säule unter normalen Flussraten ein erhöhter Rückdruck re-
sultiert, deutet dieses im Allgemeinen auf eine Verunreinigung des Packungsmaterials hin, die entfernt werden
muss (siehe Behebung möglicher Fehler).
Temperatur
Säulentemperaturen von 20 °C bis zu 35 °C sind für PAH-Trennungen üblich. Als maximale Temperatur für die
Säulen sind 60 °C möglich. Jedoch verringern erhöhte Temperaturen die Lebensdauer. Damit eine einwand-
freie Detektion gewährleistet ist, sollte sie allerdings mindestens 30 °C unter dem Siedepunkt des Eluenten lie-
gen. Durch Variation der Temperatur wird die Retentionszeit, der Rückdruck und insbesondere die Peakform
beeinflusst.
Detektion
Mit den Säulen können spektralphotometrische, massenspektrometrische, refraktometrische und elektrochemi-
sche Detektoren benutzt werden. Für die Detektion von PAHs werden UV- (250–280 nm), Diodenarray- oder Flu-
oreszenzdetektion bei unterschiedlichen Wellenlängen für Anregung und Emission genutzt. (Der Fluoreszenz-
nachweis von Acenaphthylen ist nicht möglich.)
Equilibrierung
Bevor Proben gemessen werden können, muss die Säule mit dem Eluenten bei gleicher Flussrate und Tempe-
ratur der anzuwendenden Methode gespült werden. Die Säule ist equilibriert, wenn die Basislinie des Detektors
keine Drift mehr aufweist (i. d. R. nach 10 Säulenvolumina).
Säulenaufbewahrung
Für die Aufbewahrung wird der ursprüngliche Eluent Acetonitril – Wasser (70:30, v/v) empfohlen. Verwenden
Sie für die Langzeitlagerung keine mobilen Phasen, die anorganische Salze enthalten. Auch Methanol empfiehlt
sich aufgrund möglicher Verunreinigung mit Metallionen (z. B. Eisen(III)) nicht für eine längere Lagerung. Stellen
Sie bitte sicher, dass die Verschlussschrauben fest schließen, da ansonsten das Packungsmaterial austrocknen
kann. In diesem Fall spülen Sie zunächst mit ca. 10 Säulenvolumina des Lagereluenten und einer Flussrate von
maximal 0,2 mL/min.
Deutschland und International:
Germany and international:
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
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Neumann-Neander-Str. 6–8 · 52355 Düren · Deutschland
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Tel.: +49 24 21 969-0 · Fax: +49 24 21 969-199
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PAH
PAH
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C PAH haben Sie
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. Diese Säulen sind spe-
· Säulenaufbewahrung
· Behebung möglicher Fehler
· Säulenregenerierung
· Zusammenfassung
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C PAH-Säulen eine spezielle Octadecylphase für die effizi-
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10
6
3
9
11 12
5
13
7
14 15
1 4
8
2
I
II
λ 275 375 335 315 330 375
ex
λ
350 425 440 405 420 460
em
0 1 2
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Xtra PET, 0,45 μm, 25 mm,
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) nicht überschreiten sollte. Methanol – Wasser
Schweiz:
Switzerland:
MACHEREY-NAGEL AG
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Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Schweiz
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Tel.: 062 388 55 00 · Fax: 062 388 55 05
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sales-ch@mn-net.com
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Behebung möglicher Fehler
Das folgende Schema beschreibt typische Symptome eines Leistungsverlustes und deren Ursache. Alle Säulen
® erworben; unterliegen den strengen Richtlinien und Kontrollen unserer Qualitätssicherung. Säulen auf Kieselgelbasis sind
naturgemäß sehr robust und halten bei korrekter Pflege und Behandlung ihre Trennleistung über lange Zeiträu-
me aufrecht. Erfahrungsgemäß sind Säulenausfälle meist auf eine Verunreinigung des Sorbensbettes zurückzu-
führen. Verwendung einer Vorsäule sowie sachgerechte Probenvorbehandlung verhindern meist diese Probleme.
Benutzen Sie folgendes Schema, um die Ursache eines möglichen Leistungsabfalls zu ermitteln:
Symptom / Fehler / Ursache
Basislinien-Drift
· nicht ausreichende Zeit zur
Gleichgewichtseinstellung mit dem Eluenten
· verunreinigter Eluent
· Temperatur
Breite Peaks
· Mischung und / oder Diffusion vor / hinter der Säule
· zu großes Probenvolumen
Peaküberlagerung; zu schnelle Elution
zu schnelle Elution und / oder unzureichende
Trennung durch:
· nicht angemessene Säulentemperatur oder
Eluentenflussrate
· Elutionskraft des Eluenten zu hoch
Steigender Rückdruck; Verschlechterung der
Trennung
Verunreinigung des Sorbens durch:
· Ansammlung von Partikeln auf der Fritte oder im
Sorbensbett aus der Probe, dem Eluenten oder
dem System
· Ausfall von Puffersalzen
Unzureichende Trennung; Verschlechterung der
® C PAH-
Trennung bei normalem Säulendruck
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Verunreinigung mit:
· Fette, Öle, Lipide aus der Probe (Belegung der
Sorbensoberfläche) und andere organische
Substanzen aus unsachgemäß aufbereiteten
Eluenten und Matrices
Doppelpeaks (Totvolumen):
· fehlerhafte Verschraubungen (Kapillaren, Ferrules,
Schrauben)
· Auflösung des Kieselgels durch zu hohen pH-Wert
des Eluenten
Säulenregenerierung
In einigen Fällen kann die Trennleistung der Säule wiederhergestellt werden, indem man die Verunreinigungen
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vom Sorbensbett entfernt bzw. die Phase regeneriert. Allerdings ist es wichtig, die Ursache der Verunreinigung
zu lokalisieren, bevor die Säule wieder für die Analyse von Proben verwendet wird.
1. Frischen Eluenten zubereiten: Manchmal wird der Leistungsabfall durch eine Verunreinigung des Eluenten
verursacht. Verwenden Sie deshalb stets frischen Eluenten und spülen Sie alle Flüssigkeitsleitungen, bevor
Sie die Säule weiter benutzen. Der Eluent sollte vor Gebrauch durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert und
entgast werden.
2. Reinigen des Sorbens: Zur Entfernung von Verunreinigungen spülen Sie die Säule mit mind. 10 Säulenvolumi-
na (siehe Tabelle unten) bei der ursprünglichen Flussrate und Temperatur wie folgt:
· Bei der Anwendung eines Puffers zunächst mit Acetonitril – Wasser oder Methanol – Wasser (10:90, v/v)
· 100 % Methanol um polare organische Verbindungen zu entfernen
345 300 nm
· 100 % Acetonitril um mittelpolare organische Verbindungen zu entfernen (evtl. T= 40 °C)
420 500 nm
· 100 % Tetrahydrofuran um unpolare organische Verbindungen zu entfernen
3 min
· Ggf. mit 100 % Tetrahydrofuran in umgekehrter Flussrichtung bei 1/5 der ursprünglichen Flussrate
· Säule in ursprünglicher Flussrichtung mit Acetonitril – Wasser (70:30, v/v) auf Lagerbedingung umstellen
Ein entsprechender Hinweis für die erfolgreiche Reinigung ist die Konstanz der Basislinie. Beim isokratischen
Lauf mit konstanter Temperatur sollte innerhalb einer Laufzeit von 5 Minuten nicht mehr als 2–3 mAU Drift be-
obachtet werden.
3. Regenerierung: Nach der Anwendung von Puffern spülen Sie unmittelbar nach dem Abschluss der Messrei-
he und stets vor einer Lagerung der Säule mit mind. 10 Säulenvolumina bei der ursprünglichen Flussrate und
Temperatur wie folgt:
· Acetonitril – Wasser oder Methanol – Wasser (10:90, v/v) zur Entfernung des Puffers
· schrittweise um 20 % den organischen Anteil auf die Bedingungen der neuen Messreihe erhöhen
· oder schrittweise um 20 % den Anteil an Acetonitril auf die Lagerbedingungen erhöhen
4. Säulenaustausch: Die hier beschriebenen Vorschläge können die Trennleistung der Säule leider nicht in allen
Fällen wieder herstellen. Bestimmte organische Verunreinigungen lassen sich durch die beschriebenen Rei-
nigungsmethoden nicht immer entfernen. Auch Totvolumen durch Kompression des Säulenbettes lässt sich
i. d. R. nicht beheben, so dass die Säule ausgewechselt werden muss. Wir empfehlen dringend, die Ursache
des Problems zu ermitteln, bevor Sie eine neue Säule einsetzen.
Länge [mm]
100
150
250
Zusammenfassung
Um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, berücksichtigen Sie bitte folgende Hinweise:
1. Als Eluenten werden organisch-wässrige Eluentensysteme empfohlen (z. B. Acetonitril oder Methanol – Was-
ser). Bitte bei der Verwendung von Puffern die Regenerierung beachten. Die Eluenten sollten durch eine 0,2–
0,45 μm Membran filtriert und entgast werden.
2. Filtrieren Sie die Proben vor der lnjektion mit einem 0,2–0,45 μm CHROMAFIL
3. Die Verwendung einer Vorsäule bei matrixbelasteten Proben (z. B. Boden, Öl, Lebensmittel) ist ratsam.
4. Die empfohlene Flussrate für analytische Säulen (ID 2–4,6 mm) beträgt 0,2–2,0 mL/min.
5. Stellen Sie die Flussrate so ein, dass der maximale Rückdruck Ihrer Säule nicht überschritten wird.
6. Lagern Sie die Säule (nach Entfernen des Puffers) in Acetonitril – Wasser (70:30, v/v).
7. Benutzen Sie für alle Arbeiten Reagenzien von mindestens p. A. Qualität und Lösemittel in HPLC-Qualität.
Verwerfen Sie alle Lösungen, die Anzeichen von Bakterienwachstum zeigen.
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1, rue Gutenberg · 67722 Hoerdt · Frankreich
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Tel.: 03 88 68 22 68 · Fax: 03 88 51 76 88
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Vorbeugung / Behebung
längeres bzw. besseres Equilibrieren
frische Lösemittel und Reagenzien verwenden
Säulenthermostatisierung
Länge und ID der Kapillaren möglichst klein halten
geringes Injektionsvolumen
entsprechenden Parameter optimieren
Eluentensystem optimieren
Eluenten frisch zubereiten, Proben und Eluenten vor-
her filtrieren, In-Line-Filter verwenden / LC-System
spülen, reinigen des Sorbens
Löslichkeit der Puffersalze zuvor prüfen / Entfernen
durch Spülung (siehe Säulenregenerierung)
organische Substanzen durch Probenvorbereitung
entfernen / reinigen des Sorbens
(siehe Säulenregenerierung)
Verwendung von „PEEK Fingertight Fittings",
REF 718770 / Austausch der Verschraubungen
pH-Stabilität von 2–8 der Säule beachten /
Säulenaustausch
Säulenvolumen [mL]
ID [mm]: 2 3 4 4,6
0,30 0,70 1,25 1,65
0,45 1,05 1,90 2,50
0,80 1,75 3,15 4,15
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Tel.: 484 821 0984 · Fax: 484 821 1272
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