Microscopía De Campo Oscuro; Principios De Microscopía A Inmersión En Aceite - Optika Italy B-380 Serie Handbuch

11. Microscopía de campo oscuro
El B-383DK es un sistema de campo oscuro específico para el análisis de sangre con un condensador de cam-
po oscuro 1.36 - 1.25 N.A. especial extra eficiente y un objetivo plan-acromático 100X con diafragma de iris
ajustable.
La iluminación X-LED garantiza el alto nivel de intensidad de luz que normalmente se necesita en las técnicas
de campo oscuro de gran aumento.
Para utilizar correctamente este microscopio, hay que familiarizarse con él:
a. técnica de inmersión en aceite
b. técnica de campo oscuro.
En el siguiente manual se presentan las bases de estos métodos (capítulos 11.1 y 11.2) y a continuación se
ofrece una guía paso a paso de la configuración del B-383DK (capítulo 11.3).
También se dan consejos generales para la microscopía de inmersión.
11.1 Principios de microscopía a inmersión en aceite
La capacidad de un objetivo de microscopio para capturar
los rayos de luz desviados de una muestra depende tanto
de la apertura numérica como del medio a través del cual
viaja la luz.
La apertura numérica de un objetivo es directamente pro-
porcional al índice de refracción del medio de imagen entre
la cubreobjetos y la lente frontal, y también al pecado de la
mitad de la apertura angular del objetivo.
Debido a que el pecado no puede ser mayor de 90 grados,
la apertura numérica máxima posible se determina por el
índice de refracción del medio de inmersión.
La mayoría de los objetivos del microscopio utilizan el aire
como el medio a través del cual los rayos de luz deben pa-
sar entre el cubreobjetos, protegiendo la muestra y la lente
frontal del objetivo. Los objetivos de este tipo se denominan
objetivos secos porque se utilizan sin medios líquidos de
imagen.
El aire tiene un índice de refracción de 1.0003, muy cercano
al del vacío y considerablemente inferior al de la mayoría de
los líquidos, incluyendo el agua (n = 1.33), la glicerina (n =
1.470) y los aceites de inmersión comunes para microsco-
pios (media n = 1.515).
En la práctica, la apertura numérica máxima de un sistema
de objetivo seco está limitada a 0.95, y los valores mayores
sólo pueden lograrse utilizando ópticas diseñadas para medios de inmersión.
El principio de la inmersión en aceite se muestra en la Fig. 21, donde los rayos de luz individuales se trazan a
través de la muestra y pasan al objetivo o se refractan en otras direcciones. La Fig. 21(a) ilustra el caso de un
objetivo seco con cinco rayos (marcados del 1 al 5) que pasan a través de una muestra que está cubierta con un
cubreobjetos. Estos rayos se refractan en la interfase coverslip-air y sólo los dos rayos más cercanos al eje óp-
tico (rayos 1 y 2) del microscopio tienen el ángulo apropiado para entrar en la lente frontal del objetivo. El tercer
rayo se refracta en un ángulo de unos 30 grados con respecto al cubreobjetos y no entra en el objetivo. Los dos
últimos rayos (4 y 5) se reflejan internamente a través del cubreobjetos y, junto con el tercer rayo, contribuyen
a la reflexión interna de la luz en las superficies de cristal que tienden a degradar la resolución de la imagen.
Cuando el aire es reemplazado por aceite del mismo índice de refracción que el vidrio, como se muestra en
la Fig. 21(b), los rayos de luz pasan directamente a través de la interfaz vidrio-aceite sin desviarse debido a la
refracción. La apertura numérica se incrementa así por el factor n, el índice de refracción del aceite.
Inmersión en aceite y
Apertura numérica
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Fig. 21