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Leica Microsystems Heidelberg GmbH
Allgemeines
In einem solchen hypothetischen Instrument würde das Auflösungsvermögen lediglich durch die
Beugung begrenzt. Man kann dies ausdrücken als den kleinsten Abstand zwischen zwei Punkten in
einer Probe, bei dem sie noch immer als zwei getrennte Punkte gesehen werden (Rayleighkriterium).
Über diese Grenze hinaus verschmelzen die beiden Punkte miteinander (d.h. ihre
Beugungsscheibchen überlappen ganz oder teilweise) und können nicht mehr als zwei
unterschiedliche Punkte erkannt werden. Dieser Abstand läßt sich aus der Größe Beugungsbildes
eines unendlich kleinen Punktes der Probe berechnen. Er entspricht dem Radius des ersten
Minimums in diesem Beugungsbild. Dies wiederum hängt mit den numerischen Aperturen des
Objektivs und des Kondensors zusammen. Die numerische Apertur wird durch den Brechungsindex
der Linse und die Größe des Lichtkegels definiert, der eindringen kann.
Analog zu der oben geführten Argumentation kann die axiale Auflösung definiert werden als der
Radius des ersten Minimums entlang der Mikroskopachse des Beugungsbildes eines Punktobjekts.
Entsprechend der Theorie für derartige 3D-Beugungsbilder, ist das optische Auflösungsvermögen
entlang der z-Achse um den Faktor 2 geringer als das laterale optische Auflösungsvermögen. Die
optische Auflösung entlang der z-Achse beträgt damit etwa die Hälfte der Auflösung innerhalb der
Fokalebene.
Bei dem LEICA TCS SP2-Mikroskop handelt es sich um ein echtes Punkt-Scanning-System mit
extrem hoher Empfindlichkeit und theoretischer x-, y- und z-Auflösung, das keine Kompromisse
eingeht.
Die Scan-Auflösung bezieht sich auf die Bildschärfe, die durch Anzahl und Größe der Pixel bestimmt
wird. Je größer die Anzahl Pixel und je größer das Scanformat gewählt wird, um so leichter können
zwei nah beieinander liegende Objekte unterschieden werden. Die Scan-Auflösung ist auf das
maximale optische Auflösungsvermögen beschränkt.
Detektion
Das konfokale Abbilden, genauer, das Messen der optischen Eigenschaften sehr kleiner Mengen
einer Probe, wird nicht nur durch die optische Qualität des Mikroskops beschränkt. Andere
Beschränkungen sind:
- Kontinuierliche Proben werden (aufgrund von Probenentnahme und digitaler Verarbeitung) nur in
getrennten kleinen Probemengen gemessen.
- Die Exaktheit mit der diese kleinen Mengen definiert sind, wird durch den Scan-Mechanismus
bestimmt.
- Die Stärke der Lichtquelle in Relation zum Reflexionsvermögen der Probe.
- Die Empfindlichkeit und das Rauschen des Detektors.
Auch der Detektor ist eine zentrale Komponente im konfokalen Mikroskop.Aufgrund ihres sehr hohen
Signal-zu-Rauschverhältnisses, setzt LEICA Microsystems Heidelberg Photomultiplier als Detektoren
ein.
Bildbearbeitung
Bei den ersten konfokalen Mikroskopen war der Detektor an ein Oszilloskop mit nachleuchtendem
Phosphor angeschlossen, und das Bild wurde so anzeigt, wie es gescannt wurde. In den heutigen
Geräten wird das Signal zunächst digital verarbeitet und dann von einem Computer aufgezeichnet.
Dadurch besteht nun die Möglichkeit, das angezeigte Bild auf vielfache Weise zu verändern.
Folgende Möglichkeiten bestehen:
- Verstärken der Kontraste durch Schwellwerte, lineare Kontraststreckung und Gammakorrektur
(Kurvenverlauf des Bildintensitätswertes vs. graphische Darstellung der Quellenintensität).
- Doppelbelichtung von Bildern in Experimenten.
- Digitales Filtern zum Vergrößern von Kanten, zum Glätten, Entstören etc.
- Rekonstruktion von 3D-Ansichten mit Hilfe von zu Bildstapeln zusammengesetzten optischen
Schnitten. Dies ermöglicht beispielsweise, die Rekonstruktion eines Bildes einer xz-Ebene anhand
von Bildstapeln von xy-Ebenen. Zudem können vollständige 3D-Modelle der Probe erstellt und aus
jeder beliebigen Richtung untersucht werden.
- Zusammenstellung von digitalen Filmen anhand von mit dem Mikroskop aufgenommenen Zeitserien.
- Quantisierung und Messungen
Diese Art der Bildbearbeitung erhöht nicht die Qualität der gesammelten Daten; sie dient jedoch dazu,
die Sicht zu verbessern und die qualitative Interpretation der Daten zu erleichtern.
Lichtquelle
Laser eignen sich in der konfokalen Mikroskopie hervorragend als Lichtquellen, da sie sehr helles
Licht abgeben und der Strahl nur eine geringe Abweichung aufweist. Darüber hinaus sind sie sehr
einfach zu fokussieren und stabil in der Intensität. Gerade diese Stabilität ist bei quantitativen
Messungen von Bedeutung.
Benutzerhandbuch Leica TCS SP2 deutsch
Art.Nr.: 15-9330-052 / Vers.: 14012003
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