MACHEREY-NAGEL NUCLEOSIL SA Bedienungsanleitung

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NUCLEOSIL SA
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NUCLEOSIL SB
Bitte beachten: Allen HPLC-Säulen von MACHEREY-NAGEL liegt ein Zertifikat bei, dem spezifische Da-
ten und Testergebnisse der Säule entnommen werden können. Mit den Säulen NUCLEOSIL
NUCLEOSIL ® SB haben Sie ein Qualitätsprodukt auf Basis des bewährten, robusten Kieselgel NUCLEOSIL
erworben. Sie sind speziell für den Einsatz in der chromatographischen Hochleistungsanalytik entwickelt worden.
Bei sorgfältiger und sachgerechter Verwendung können beste Trennresultate und eine lange Lebensdauer erzielt
werden. Dieses Produkt kann zur Trennung von Gemischen und zur quantitativen Bestimmung der darin enthal-
tenen Komponenten eingesetzt werden. Alle HPLC-Trennsäulen sind gemäß den allgemeingültigen Prinzipien
und Arbeitstechniken der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zu verwenden. Der korrekte Ablauf der analy-
tischen Methodik und insbesondere die Prüfung der Leistungsfähigkeit des kompletten Analysensystems, also
Trennsäule und HPLC-Anlage sowie die Anpassung der Analysenbedingungen an die Erfordernisse der jewei-
ligen Aufgabenstellung liegt in der Verantwortung des Kunden und ist durch den jeweiligen Anwender sicherzustel-
len. MACHEREY-NAGEL übernimmt keine Garantie oder Gewährleistung für die erfolgreiche Durchführung von
Applikationen oder Trennungen. Falls Sie nach dem Lesen dieser Anleitung noch Fragen haben sollten, wenden
Sie sich bitte an unseren Service / technische Produktberatung.
Inhaltsübersicht
· Sicherheitshinweise · Eluent
· Beschreibung der Säulen · Flussrate und Druck
· Installation · Temperatur
· Vorsäulen · Detektion
· Probe · Equilibrierung
Sicherheitshinweise
Beachten Sie die allgemeinen Gefahrenhinweise für die jeweiligen Mobilphasensysteme (z. B. Zusätze von
Methanol, Acetonitril oder Säuren) und treffen Sie beim Arbeiten entsprechende Schutzmaßnahmen, z. B. Au-
genschutz gegen austretende Flüssigkeiten bei plötzlichem Bruch von Kapillarverbindungen. Bitte führen Sie
verbrauchte HPLC-Säulen gemäß den landesspezifischen Umweltrichtlinien einer fachgerechten Entsorgung
zu. Gewährleisten Sie, dass die Trennsäulen nur von dem dafür zuständigen Fachpersonal eingesetzt werden.
Lassen Sie HPLC-Säulen nicht in die Hände von Kindern gelangen. Jegliche Garantie oder Gewährleistung
von MACHEREY-NAGEL erlischt, falls durch unsachgemäße Verwendung oder Behandlung (insbesondere das
Öffnen der Säule und Freilegen des Säulenbettes) Folgeschäden auftreten.
Beschreibung der Säulen
Als stationäre Phase enthalten die NUCLEOSIL
bei dem sphärisches Kieselgel mit Benzolsulfonsäure modifiziert wurde. Die NUCLEOSIL
einem stark basischen Anionenaustauscher (SAX), einer quaternären Ammoniummodifizierung, gepackt. Beide
Phasen weisen eine Ionenaustauscherkapazität von ca. 1 meq/g auf.
Typische Applikationen des Kationenaustauschers NUCLEOSIL
löslichen Substanzen. Die Retention der basischen Analyten wird durch den pH-Wert und der Ionenstärke der
mobilen Phase bestimmt (siehe Eluent).
Der Anionenaustauscher NUCLEOSIL ® SB wird zur Trennung von Substanzen angewendet, die in wässrigen
Lösungen Anionen bilden. Solche Substanzen finden sich v.a. bei organischen Säuren (aromatischen und ali-
phatischen Carbon- und Sulfonsäuren), aber auch bei Pestziden und Pharmazeutika.
Installation
Der Einbau der HPLC-Säulen sollte unter Berücksichtigung der Flussrichtung, die auf dem Säulenetikett ver-
merkt ist, erfolgen. Sie werden mit gerätetypischen 1/16" Kapillaren und Verschraubungen angeschlossen.
Vorsäulen
Zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der Säule sollten immer Vorsäulen verwendet werden. Die
Filterelemente und das Sorbens der Vorsäule halten Verunreinigungen aus der Probe oder dem Eluenten zurück.
Der Anschluss der Vorsäule an die Trennsäule erfolgt mittels Vorsäulenhalter (siehe hierzu www.mn-net.com
oder MN Chromatographie-Katalog). Ein Wechsel der Vorsäule ist erforderlich, sobald eine Erhöhung des Säu-
lendruckes und / oder eine Verschlechterung der Trennleistung beobachtet wird.
Probe
Die Probe wird in der Regel im Eluenten gelöst und vor der Aufgabe auf die Säule durch die Verwendung eines
Spritzenvorsatzfilters (z. B. CHROMAFIL ® Xtra PET, 0,45 μm, 25 mm, REF 729220) gereinigt. Falls trotz Filtration
noch trübe Lösungen in die Säule injiziert werden, kann das die Lebensdauer der Säule beträchtlich verkürzen.
Das Probenvolumen sollte für eine optimale Auflösung möglichst klein gewählt werden.
Eluent
Die Ionenaustauschersäulen NUCLEOSIL ® SA und SB werden mit einer Lösung von 0,15 mol/L Diammoni-
umhydrogenphosphat, pH 5 ausgeliefert. Als mobile Phasen werden wässrige Puffer (z. B. Phosphat-, Acetat-,
Citratpuffer) eingesetzt. Die Eluenten sollten durch einen 0,2–0,45 μm Membranfilter filtriert und entgast werden.
Der pH-Wert kann, entsprechend dem pK -Wert der Analyten, mit korrespondierenden Säuren (z. B. Phosphor-,
s
Essig-, Citronensäure) eingestellt werden, sollte aber im Bereich 2–8 liegen. Stark saure oder basische Bedin-
gungen können zur Auflösung des Säulenbettes oder zur Abtrennung der organischen Modifizierung führen. Der
Gehalt an Puffersalzen sollte so niedrig wie möglich sein (max. Pufferkonzentration: 0,15 mol/L). Organische Zu-
sätze (z. B. Methanol, Acetonitril) können zur Verbesserung der Probenlöslichkeit oder der Trennung verwendet
werden. Beachten Sie bei der Zugabe des organischen Zusatzes, dass es nicht zur Ausfällung von Puffersalzen
und schließlich zur Verstopfung der Säule kommt.
Flussrate und Druck
Die Flussrate (empfohlen für analytische Säulen mit 2–4.6 mm ID: 0,2–2,0 mL/min) beeinflusst den Zeitaufwand
der Trennung, die Auflösung und die Lebensdauer der Säule. Sie ist durch den Rückdruck begrenzt, der den
Maximalwert von 400 bar nicht überschreiten sollte. Wir empfehlen den Rückdruck regelmäßig zu überprüfen.
Wenn bei der Benutzung der Säule unter normalen Flussraten ein erhöhter Rückdruck resultiert, deutet dieses
im Allgemeinen auf eine Verunreinigung des Packungsmaterials hin, die entfernt werden muss (siehe Behebung
möglicher Fehler).
Temperatur
Säulentemperaturen bis zu 60 °C sind geeignet. Für eine lange Lebensdauer, insbesondere unter basischen
Bedingungen, werden 30–40 °C empfohlen. Sie sollten allerdings mindestens 30 °C unter dem Siedepunkt des
Eluenten liegen, damit eine einwandfreie Detektion gewährleistet ist. Durch Variation dieser Größe wird die
Retentionszeit, der Rückdruck und insbesondere die Peakform beeinflusst. Die optimalen Temperaturen für er-
folgreiche Trennungen müssen daher empirisch ermittelt werden.
Detektion
Mit den Säulen können spektralphotometrische, refraktometrische und elektrochemische Detektoren benutzt
werden. Falls eine höhere Empfindlichkeit erforderlich ist, können Nachsäulenderivatisierungen mit einem geeig-
neten Detektor für die Reaktionsprodukte eingesetzt werden.
Equilibrierung
Bevor Proben gemessen werden können, muss die Säule mit dem Eluenten bei gleicher Flussrate und Tempe-
ratur der anzuwendenden Methode gespült werden. Die Säule ist equilibriert, wenn die Basislinie des Detektors
keine Drift mehr aufweist (i. d. R. nach 10 Säulenvolumina).
Säulenaufbewahrung
Für die Aufbewahrung wird der ursprüngliche Eluent 0,15 mol/L Diammoniumhydrogenphosphat, pH 5 empfoh-
len. Um ein mögliches Bakterienwachstum auszuschließen, sollte die Säule im Kühlschrank aufbewahrt wer-
den. Stellen Sie bitte sicher, dass die Verschlussschrauben fest schließen, da ansonsten das Packungsmaterial
austrocknen kann. In diesem Fall spülen Sie zunächst mit ca. 10 Säulenvolumina des Lagereluenten und einer
Flussrate von maximal 0,2 mL/min.
Deutschland und International:
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Neumann-Neander-Str. 6–8 · 52355 Düren · Deutschland
Tel.: +49 24 21 969-0 · Fax: +49 24 21 969-199
info@mn-net.com · www.mn-net.com
· Säulenaufbewahrung
· Behebung möglicher Fehler
· Säulenregenerierung
· Zusammenfassung
® SA Säulen einen stark sauren Kationenaustauscher (SCX),
®
SB Säulen sind mit
®
SA sind Trennungen von basischen, wasser-
Schweiz:
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Schweiz
Tel.: 062 388 55 00 · Fax: 062 388 55 05
sales-ch@mn-net.com
Behebung möglicher Fehler
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SA und Das folgende Schema beschreibt typische Symptome eines Leistungsverlustes und deren Ursache. Alle Säulen
® unterliegen den strengen Richtlinien und Kontrollen unserer Qualitätssicherung. Säulen auf Kieselgelbasis sind
naturgemäß sehr robust und halten bei korrekter Pflege und Behandlung ihre Trennleistung über lange Zeiträume
aufrecht. Erfahrungsgemäß sind Säulenausfälle meist auf eine Verunreinigung des Sorbensbettes zurückzuführen.
Verwendung einer Vorsäule sowie sachgerechte Probenvorbehandlung verhindern meist diese Probleme.
Benutzen Sie folgendes Schema, um die Ursache eines möglichen Leistungsabfalls zu ermitteln:
Symptom / Fehler / Ursache
Basislinien-Drift
· nicht ausreichende Zeit zur Gleichgewichtseinstel-
lung mit dem Eluenten
· verunreinigter Eluent
· Temperatur
Breite Peaks
· Mischung und / oder Diffusion vor / hinter der Säule
· zu großes Probenvolumen
Peaküberlagerung; zu schnelle Elution
zu schnelle Elution und / oder unzureichende
Trennung durch:
· nicht angemessene Säulentemperatur oder
Eluentenflussrate
· Elutionskraft des Eluenten zu hoch
Steigender Rückdruck; Verschlechterung der
Trennung
Verunreinigung des Sorbens durch:
· Ansammlung von Partikeln auf der Fritte oder im
Sorbensbett aus der Probe, dem Eluenten oder
dem System
· Ausfall von Puffersalzen
Unzureichende Trennung; Verschlechterung der
Trennung bei normalem Säulendruck
Verunreinigung mit:
· Fette, Öle, Lipide aus der Probe (Belegung der
Sorbensoberfläche) und andere organische Sub-
stanzen aus unsachgemäß aufbereiteten Eluenten
und Matrices
Doppelpeaks (Totvolumen):
· fehlerhafte Verschraubungen (Kapillaren, Ferrules,
Schrauben)
· Auflösung des Kieselgels durch zu hohen pH-Wert
des Eluenten
Säulenregenerierung
In einigen Fällen kann die Trennleistung der Säule wiederhergestellt werden, indem man die Verunreinigungen
vom Sorbensbett entfernt bzw. die Phase regeneriert. Allerdings ist es wichtig, die Ursache der Verunreinigung
zu lokalisieren, bevor die Säule wieder für die Analyse von Proben verwendet wird.
1. Frischen Eluenten zubereiten: Manchmal wird der Leistungsabfall durch eine Verunreinigung des Eluenten
verursacht. Verwenden Sie deshalb stets frischen Eluenten und spülen Sie alle Flüssigkeitsleitungen, bevor
Sie die Säule weiter benutzen. Der Eluent sollte vor Gebrauch durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert und
entgast werden.
2. Reinigen des Sorbens: Zur Entfernung von Verunreinigungen spülen Sie die Säule mit mind. 10 Säulenvolumi-
na (siehe Tabelle unten) bei der ursprünglichen Flussrate und Temperatur wie folgt.
· 100 % Wasser zur Entfernung des Puffers und ionischer Verunreinigungen
(Kationische Verunreinigungen können bei der SA-Phase auch mit 1 mol/L Natriumperchlorat, pH <4
entfernt werden.)
· 100 % Methanol um nicht-ionische organische Verbindungen zu entfernen (zuvor Puffer entfernen)
· Ggf. mit 100 % Methanol in umgekehrter Flussrichtung bei 1/5 der ursprünglichen Flussrate
· Säule in ursprünglicher Flussrichtung mit 10 Säulenvolumina 100 % Wasser umspülen
· Schließlich mit 0,15 mol/L Diammoniumhydrogenphosphat, pH 5 auf Lagerbedingung umstellen
Ein entsprechender Hinweis für die erfolgreiche Reinigung ist die Konstanz der Basislinie. Beim isokratischen
Lauf mit konstanter Temperatur sollte innerhalb einer Laufzeit von 5 Minuten nicht mehr als 2–3 mAU Drift
beobachtet werden.
3. Säulenaustausch: Die hier beschriebenen Vorschläge können die Trennleistung der Säule leider nicht in allen
Fällen wieder herstellen. Bestimmte organische Verunreinigungen lassen sich durch die beschriebenen Rei-
nigungsmethoden nicht immer entfernen. Auch Totvolumen durch Kompression des Säulenbettes lässt sich
i. d. R. nicht beheben, so dass die Säule ausgewechselt werden muss. Wir empfehlen dringend, die Ursache
des Problems zu ermitteln, bevor Sie eine neue Säule einsetzen.
Länge [mm]
100
150
250
Zusammenfassung
Um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, berücksichtigen Sie bitte folgende Hinweise:
1. Als Eluenten werden wässrige Puffer (z. B. Phosphat-, Acetat-, Citratpuffer) empfohlen. Bei der Verwendung
von organischen Zusätzen (z. B. Methanol) ist ein Ausfällen von Puffersalzen zu vermeiden. Die Eluenten
sollten durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert und entgast werden.
2. Filtrieren Sie die Proben vor der lnjektion mit einem 0,2–0,45 μm CHROMAFIL
filter.
3. Verwenden Sie bei verschmutzten Proben eine Vorsäule.
4. Die empfohlene Flussrate für analytische Säulen (ID 2–4.6 mm) beträgt 0,2–2,0 mL/min.
5. Stellen Sie die Flussrate so ein, dass der Säulendruck unter 400 bar bleibt.
6. Lagern Sie die Säule in 0,15 mol/L Diammoniumhydrogenphosphat, pH 5.
7. Benutzen Sie für alle Arbeiten Reagenzien von mindestens p. A. Qualität und Lösemittel in HPLC-Qualität.
Verwerfen Sie alle Lösungen, die Anzeichen von Bakterienwachstum zeigen.
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Tel.: 03 88 68 22 68 · Fax: 03 88 51 76 88
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Vorbeugung / Behebung
längeres bzw. besseres Equilibrieren
frische Lösemittel und Reagenzien verwenden
Säulenthermostatisierung
Länge und ID der Kapillaren möglichst klein halten
geringes Injektionsvolumen
entsprechenden Parameter optimieren
Eluentensystem optimieren
Eluenten frisch zubereiten, Proben und Eluenten
vorher filtrieren, In-Line-Filter verwenden / LC-System
spülen, reinigen des Sorbens
Löslichkeit der Puffersalze zuvor prüfen / Entfernen
durch Spülung (siehe Säulenregenerierung)
organische Substanzen durch Probenvorbereitung
entfernen / reinigen des Sorbens
(siehe Säulenregenerierung)
Verwendung von „PEEK Fingertight Fittings",
REF 718770 oder REF 718778 / Austausch der
Verschraubungen
pH-Stabilität der Säule beachten / Säulenaustausch
Säulenvolumen [mL]
Innendurchmesser [mm]: 2 3 4
0,30 0,70 1,25
0,45 1,05 1,90
0,80 1,75 3,15
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USA:
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