MACHEREY-NAGEL NUCLEODUR CN Bedienungsanleitung

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NUCLEODUR CN / CN-RP
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NUCLEOSIL CN / CN-RP
Bitte beachten: Allen HPLC-Säulen von MACHEREY-NAGEL liegt ein Zertifikat bei, dem spezifische Da-
ten und Testergebnisse der Säule entnommen werden können. Mit der Säule NUCLEODUR
Säule CN-RP haben Sie ein Qualitätsprodukt auf Basis des hochreinen und sehr druckstabilen Kieselgels
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NUCLEODUR erworben; NUCLEOSIL CN bzw. CN-RP basiert auf dem bewährten, robusten Kieselgel
NUCLEOSIL ® . Sie sind speziell für den Einsatz in der chromatographischen Hochleistungsanalytik entwickelt
worden. Bei sorgfältiger und sachgerechter Verwendung können beste Trennresultate und eine lange Lebensdau-
er erzielt werden. Dieses Produkt kann zur Trennung von Gemischen und zur quantitativen Bestimmung der darin
enthaltenen Komponenten eingesetzt werden. Alle HPLC-Trennsäulen sind gemäß den allgemeingültigen Prinzi-
pien und Arbeitstechniken der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zu verwenden. Der korrekte Ablauf der ana-
lytischen Methodik und insbesondere die Prüfung der Leistungsfähigkeit des kompletten Analysensystems, also
Trennsäule und HPLC-Anlage sowie die Anpassung der Analysenbedingungen an die Erfordernisse der jeweili-
gen Aufgabenstellung liegt in der Verantwortung des Kunden und ist durch den jeweiligen Anwender sicherzustel-
len. MACHEREY-NAGEL übernimmt keine Garantie oder Gewährleistung für die erfolgreiche Durchführung von
Applikationen oder Trennungen. Falls Sie nach dem Lesen dieser Anleitung noch Fragen haben sollten, wenden
Sie sich bitte an unseren Service / technische Produktberatung.
Inhaltsübersicht
· Sicherheitshinweise · Eluent
· Beschreibung der Säulen · Flussrate und Druck
· Installation · Temperatur
· Vorsäulen · Detektion
· Probe · Equilibrierung
Sicherheitshinweise
Beachten Sie die allgemeinen Gefahrenhinweise für die jeweiligen Mobilphasensysteme (z. B. n-Heptan oder
Acetonitril) und treffen Sie beim Arbeiten entsprechende Schutzmaßnahmen, z. B. Augenschutz gegen austre-
tende Flüssigkeiten bei plötzlichem Bruch von Kapillarverbindungen. Bitte führen Sie verbrauchte HPLC-Säulen
gemäß den landesspezifischen Umweltrichtlinien einer fachgerechten Entsorgung zu. Gewährleisten Sie, dass
die Trennsäulen nur von dem dafür zuständigen Fachpersonal eingesetzt werden. Lassen Sie HPLC-Säulen
nicht in die Hände von Kindern gelangen. Jegliche Garantie oder Gewährleistung von MACHEREY-NAGEL er-
lischt, falls durch unsachgemäße Verwendung oder Behandlung (insbesondere das Öffnen der Säule und Frei-
legen des Säulenbettes) Folgeschäden auftreten.
Beschreibung der Säulen
Als stationäre Phase enthalten die Säulen ein nach einem speziellen Verfahren mit Cyanopropyl modifiziertes
sphärisches Kieselgel. Hierbei weist die NUCLEODUR
eine besonders hohe Reproduzierbarkeit der Analysenergebnisse auf.
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Die Normalphasen-Säulen NUCLEODUR CN und NUCLEOSIL
geliefert. Sie können für die Trennung von Verbindungen (z. B. Steroide) in der Normalphasen-Chromatographie
(NP) mit unpolaren mobilen Phasen angewendet werden. Als sogenannte Multimodus-Säulen können sie aber
auch für Reversed-Phase (RP) Anwendungen in wässrig-organischen mobilen Phasen eingesetzt werden. Je-
doch wird dann ein Umspülen notwendig (siehe Eluent).
Eluent in den Reversed-Phase-Säulen NUCLEODUR
Durch die ausgeprägte Selektivität für polare organische Verbindungen (z. B. organische Säuren) sowie für Mo-
leküle mit π-Elektronensystemen (z. B. Analyten mit Doppelbindungen, tricyclische Antidepressiva) zeigt sie ein
deutlich anderes Retentionsverhalten als C - oder C
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mittelinhaltsstoffen auf verschiedenen RP-Phasen zeigt die Applikation auf der englischsprachigen Seite.) Ein
Umspülen auf NP-Bedingungen ist zwar möglich, wird aber nicht empfohlen (siehe Eluent).
Installation
Der Einbau der HPLC-Säulen sollte unter Berücksichtigung der Flussrichtung, die auf dem Säulenetikett ver-
merkt ist, erfolgen. Sie werden mit gerätetypischen 1/16" Kapillaren und Verschraubungen angeschlossen.
Vorsäulen
Zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der Säule sollten immer Vorsäulen verwendet werden. Die
Filterelemente und das Sorbens der Vorsäule halten Verunreinigungen aus der Probe oder dem Eluenten zurück.
Der Anschluss der Vorsäule an die Trennsäule erfolgt mittels Vorsäulenhalter (siehe hierzu www.mn‑net.com
oder MN Chromatographie-Katalog). Ein Wechsel der Vorsäule ist erforderlich, sobald eine Erhöhung des Säu-
lendruckes und / oder eine Verschlechterung der Trennleistung beobachtet wird.
Probe
Die Probe wird in der Regel im Eluenten gelöst und vor der Aufgabe auf die Säule durch die Verwendung eines
Spritzenvorsatzfilters (z. B. CHROMAFIL ® Xtra PET, 0,45 μm, 25 mm, REF 729220) gereinigt. Falls trotz Filtration
noch trübe Lösungen in die Säule injiziert werden, kann das die Lebensdauer der Säule beträchtlich verkürzen.
Das Probenvolumen sollte für eine optimale Auflösung möglichst klein gewählt werden.
Eluent
NP-Säulen: Eluent in der Säule ist n-Heptan. Als mobile Phasen im Normalphasen-Modus (NP) werden
n-Heptan, Hexan, Dichlormethan oder 2-Propanol eingesetzt. Die Eluenten sollten durch einen 0,2–0,45 μm
Membranfilter filtriert und entgast werden. Sollte ein Umspülen auf den Reversed-Phase-Modus (RP) notwendig
werden, muss mit 10 Säulenvolumina Tetrahydrofuran (THF) zwischengespült werden!
RP-Säulen: Sie werden mit dem Eluenten Acetonitril – Wasser (je nach Typ 80:20, 70:30 oder 60:40, v/v; siehe
Säulenzertifikat) ausgeliefert. Typische RP-Eluenten sind z. B. Acetonitril oder Methanol mit reinem Wasser oder
Puffer. Diese sollten filtriert und entgast werden. Die pH-Stabilität der NUCLEODUR
und 8, der NUCLEOSIL ® CN-RP zwischen 2 und 8. Stark saure oder basische Bedingungen, vor allem bei Säu-
lentemperaturen höher als 40 °C, können zur Auflösung des Säulenbettes oder zur Abtrennung der organischen
Modifizierung führen. Der Gehalt an Puffersalzen sollte so niedrig wie möglich sein. Beachten Sie die Löslich-
keitsgrenze des Puffers im Eluenten. Die Steigerung des organischen Anteils kann zur Ausfällung von Puffersal-
zen und Verstopfung der Säule führen. Vor Inbetriebnahme mit pufferhaltigem Eluent sollte zunächst mit mind. 10
Säulenvolumina Acetonitril – Wasser (25:75, v/v) vorkonditioniert werden. Stets nach Abschluss von Messungen
mit pufferhaltigen Eluenten sollte die Säule regeneriert werden (siehe Säulenregenierung). Ein Umspülen auf
NP-Modus wird nicht empfohlen und sollte, wenn überhaupt, nur über Zwischenspülung mit THF erfolgen.
Flussrate und Druck
Die Flussrate (empfohlen für analytische Säulen mit 2–4.6 mm ID: 0,2–2,0 mL/min) beeinflusst den Zeitaufwand
der Trennung, die Auflösung und die Lebensdauer der Säule. Sie ist durch den Rückdruck begrenzt, der den Ma-
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ximalwert von 600 bar (NUCLEODUR ) / 400 bar (NUCLEOSIL
Gemische durchlaufen bei ca. 40 % Methanolanteil ein Viskositätsmaximum. Änderungen der Eluentenzusam-
mensetzung sollten daher bei niedriger Flussrate durchgeführt werden. Wir empfehlen den Rückdruck regel-
mäßig zu überprüfen. Wenn bei der Benutzung der Säule unter normalen Flussraten ein erhöhter Rückdruck
resultiert, deutet dieses im Allgemeinen auf eine Verunreinigung des Packungsmaterials hin, die entfernt werden
muss (siehe Behebung möglicher Fehler).
Temperatur
Säulentemperaturen bis zu 60 °C sind geeignet; für eine lange Lebensdauer werden 30–40 °C empfohlen. Bei
Verwendung von Phosphatpuffern sollte die Temperatur nicht höher als 40 °C sein. Sie sollten allerdings min-
destens 30 °C unter dem Siedepunkt des Eluenten liegen, damit eine einwandfreie Detektion gewährleistet ist.
Durch Variation dieser Größe wird die Retentionszeit, der Rückdruck und insbesondere die Peakform beeinflusst.
Die optimalen Temperaturen für erfolgreiche Trennungen müssen daher empirisch ermittelt werden.
Detektion
Mit den Säulen können spektralphotometrische, refraktometrische und elektrochemische Detektoren benutzt
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werden. NUCLEODUR CN und CN-RP eignen sich ebenfalls für die LC/MS-Detektion. Falls eine höhere Emp-
findlichkeit erforderlich ist, können Nachsäulenderivatisierungen mit einem geeigneten Detektor für die Reakti-
onsprodukte eingesetzt werden.
Equilibrierung
Bevor Proben gemessen werden können, muss die Säule mit dem Eluenten bei gleicher Flussrate und Tempe-
ratur der anzuwendenden Methode gespült werden. Die Säule ist equilibriert, wenn die Basislinie des Detektors
keinen Drift mehr aufweist (i. d. R. nach 10 Säulenvolumina).
Säulenaufbewahrung
Für die Aufbewahrung wird der ursprüngliche Eluent (siehe Eluent) empfohlen. Verwenden Sie für die Lang-
zeitlagerung keine mobilen Phasen, die anorganische Salze enthalten (siehe Regenerierung). Auch Methanol
empfiehlt sich aufgrund möglicher Verunreinigung mit Metallionen (z. B. Eisen(III)) nicht für eine längere Lage-
rung. Stellen Sie bitte sicher, dass die Verschlussschrauben fest schließen, da ansonsten das Packungsmaterial
austrocknen kann. In diesem Fall spülen Sie zunächst mit ca. 10 Säulenvolumina des Lagereluenten und einer
Flussrate von maximal 0,2 mL/min.
Behebung möglicher Fehler
Das folgende Schema beschreibt typische Symptome eines Leistungsverlustes und deren Ursache. Alle Säulen
unterliegen den strengen Richtlinien und Kontrollen unserer Qualitätssicherung. Säulen auf Kieselgelbasis sind
naturgemäß sehr robust und halten bei korrekter Pflege und Behandlung ihre Trennleistung über lange Zeiträume
aufrecht. Erfahrungsgemäß sind Säulenausfälle meist auf eine Verunreinigung des Sorbensbettes zurückzuführen.
Verwendung einer Vorsäule sowie sachgerechte Probenvorbehandlung verhindern meist diese Probleme.
Deutschland und International:
MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG
Neumann-Neander-Str. 6–8 · 52355 Düren · Deutschland
Tel.: +49 24 21 969-0 · Fax: +49 24 21 969-199
info@mn-net.com · www.mn-net.com
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CN bzw. der
· Säulenaufbewahrung
· Behebung möglicher Fehler
· Säulenregenerierung
· Zusammenfassung
® Cyanophase durch eine vollständige Nachsilanisierung
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CN werden mit dem Eluenten n-Heptan aus-
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CN-RP and NUCLEOSIL CN-RP ist Acetonitril – Wasser.
-modifizierte RP-Phasen. (Die Trennung von Erkältungs-
8
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CN-RP liegt zwischen 1
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) nicht überschreiten sollte. Methanol – Wasser
Schweiz:
MACHEREY-NAGEL AG
Hirsackerstr. 7 · 4702 Oensingen · Schweiz
Tel.: 062 388 55 00 · Fax: 062 388 55 05
sales-ch@mn-net.com
Benutzen Sie folgendes Schema, um die Ursache eines möglichen Leistungsabfalls zu ermitteln:
Symptom / Fehler / Ursache
Basislinien-Drift
· nicht ausreichende Zeit zur Gleichgewichtseinstel-
lung mit dem Eluenten
· verunreinigter Eluent
· Temperatur
Breite Peaks
· Mischung und / oder Diffusion vor / hinter der Säule
· zu großes Probenvolumen
Peaküberlagerung; zu schnelle Elution
zu schnelle Elution und / oder unzureichende
Trennung durch:
· nicht angemessene Säulentemperatur oder
Eluentenflussrate
· Elutionskraft des Eluenten zu hoch
Steigender Rückdruck; Verschlechterung der
Trennung
Verunreinigung des Sorbens durch:
· Ansammlung von Partikeln auf der Fritte oder im
Sorbensbett aus der Probe, dem Eluenten oder
dem System
· Ausfall von Puffersalzen
Unzureichende Trennung; Verschlechterung der
Trennung bei normalem Säulendruck
Verunreinigung mit:
· Fette, Öle, Lipide aus der Probe (Belegung der
Sorbensoberfläche) und andere organische Sub-
stanzen aus unsachgemäß aufbereiteten Eluenten
und Matrices
Doppelpeaks (Totvolumen):
· fehlerhafte Verschraubungen (Kapillaren, Ferrules,
Schrauben)
· Auflösung des Kieselgels durch zu hohen pH-Wert
des Eluenten
Säulenregenerierung
In einigen Fällen kann die Trennleistung der Säule wiederhergestellt werden, indem man die Verunreinigungen
vom Sorbensbett entfernt bzw. die Phase regeneriert. Allerdings ist es wichtig, die Ursache der Verunreinigung
zu lokalisieren, bevor die Säule wieder für die Analyse von Proben verwendet wird.
1. Frischen Eluenten zubereiten: Manchmal wird der Leistungsabfall durch eine Verunreinigung des Eluenten
verursacht. Verwenden Sie deshalb stets frischen Eluenten und spülen Sie alle Flüssigkeitsleitungen, bevor
Sie die Säule weiter benutzen. Der Eluent sollte vor Gebrauch durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert und
entgast werden.
2. Reinigen des Sorbens: Zur Entfernung von Verunreinigungen spülen Sie die Säule mit mind. 10 Säulenvolumi-
na (siehe Tabelle unten) bei der ursprünglichen Flussrate und Temperatur wie folgt.
NP-Säulen:
· 100 % Tetrahydrofuran um un- oder mittelpolare organische Verbindungen zu entfernen
· Ggf. mit 100 % Tetrahydrofuran in umgekehrter Flussrichtung bei 1/5 der ursprünglichen Flussrate
· Säule in ursprünglicher Flussrichtung mit n-Heptan auf Lagerbedingung umstellen
RP-Säulen:
· Acetonitril – Wasser oder Methanol – Wasser (10:90, v/v) zur Entfernung des Puffers
· 100 % Methanol um polare organische Verbindungen zu entfernen
· 100 % Acetonitril um mittelpolare organische Verbindungen zu entfernen (evtl. T= 40 °C)
· 100 % Tetrahydrofuran um unpolare organische Verbindungen zu entfernen
· Ggf. mit 100 % Tetrahydrofuran in umgekehrter Flussrichtung bei 1/5 der ursprünglichen Flussrate
· Säule in ursprünglicher Flussrichtung mit Acetonitril – Wasser (80:20, 70:30 bzw. 60:40, v/v) auf
Lagerbedingung umstellen
Ein entsprechender Hinweis für die erfolgreiche Reinigung ist die Konstanz der Basislinie. Beim isokratischen
Lauf mit konstanter Temperatur sollte innerhalb einer Laufzeit von 5 Minuten nicht mehr als 2–3 mAU Drift
beobachtet werden.
Nach der Anwendung von Puffern spülen Sie RP-Säulen unmittelbar nach dem Abschluss der Messreihe
und stets vor einer Lagerung der Säule mit mind. 10 Säulenvolumina bei der ursprünglichen Flussrate und
Temperatur wie folgt:
· Acetonitril – Wasser oder Methanol – Wasser (10:90, v/v) zur Entfernung des Puffers
· schrittweise um 20 % den organischen Anteil auf die Bedingungen der neuen Messreihe erhöhen
· oder schrittweise um 20 % den Anteil an Acetonitril auf die Lagerbedingungen erhöhen
3. Säulenaustausch: Die hier beschriebenen Vorschläge können die Trennleistung der Säule leider nicht in allen
Fällen wieder herstellen. Bestimmte organische Verunreinigungen lassen sich durch die beschriebenen Rei-
nigungsmethoden nicht immer entfernen. Auch Totvolumen durch Kompression des Säulenbettes lässt sich
i. d. R. nicht beheben, so dass die Säule ausgewechselt werden muss. Wir empfehlen dringend, die Ursache
des Problems zu ermitteln, bevor Sie eine neue Säule einsetzen.
Länge [mm] Innendurchmesser [mm]:
100
150
250
Zusammenfassung
Um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, berücksichtigen Sie bitte folgende Hinweise:
1. Als NP-Eluenten werden unpolare organische Lösemittel (z. B. n-Heptan, Dichlormethan, 2-Propanol) und als
RP-Eluenten organisch-wässrige Eluentensysteme empfohlen (z. B. Acetonitril – Wasser oder Puffer). Beim
Wechsel vom NP- auf den RP-Modus muss stets mit THF zwischengespült werden. Ein umgekehrter Wechsel
wird nicht empfohlen. Die Eluenten sollten durch eine 0,2–0,45 μm Membran filtriert und entgast werden.
2. Filtrieren Sie die Proben vor der lnjektion mit einem 0,2–0,45 μm CHROMAFIL
filter.
3. Verwenden Sie bei verschmutzten Proben eine Vorsäule.
4. Die empfohlene Flussrate für analytische Säulen (ID 2-4.6 mm) beträgt 0,2–2,0 mL/min.
5. Stellen Sie die Flussrate so ein, dass der Säulendruck unter 600 (für NUCLEODUR) / 400 (für NUCLEOSIL)
bar bleibt.
6. Lagern Sie die NP-Säule in n-Heptan und die RP-Säule in Acetonitril – Wasser (70:30, v/v).
7. Benutzen Sie für alle Arbeiten Reagenzien von mindestens p. A. Qualität und Lösemittel in HPLC-Qualität.
Verwerfen Sie alle Lösungen, die Anzeichen von Bakterienwachstum zeigen.
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MACHEREY-NAGEL SARL à associé unique
1, rue Gutenberg · 67722 Hoerdt · Frankreich
Tel.: 03 88 68 22 68 · Fax: 03 88 51 76 88
sales-fr@mn-net.com
www.mn-net.com
Vorbeugung / Behebung
längeres bzw. besseres Equilibrieren
frische Lösemittel und Reagenzien verwenden
Säulenthermostatisierung
Länge und ID der Kapillaren möglichst klein halten
geringes Injektionsvolumen
entsprechenden Parameter optimieren
Eluentensystem optimieren
Eluenten frisch zubereiten, Proben und Eluenten
vorher filtrieren, In-Line-Filter verwenden / LC-System
spülen, reinigen des Sorbens
Löslichkeit der Puffersalze zuvor prüfen / Entfernen
durch Spülung (siehe Säulenregenerierung)
organische Substanzen durch Probenvorbereitung
entfernen / reinigen des Sorbens
(siehe Säulenregenerierung)
Verwendung von „PEEK Fingertight Fittings",
REF 718770 oder REF 718778 / Austausch der
Verschraubungen
pH-Stabilität der Säule beachten / Säulenaustausch
Säulenvolumen [mL]
2 3 4 4,6
0,30 0,70 1,25 1,65
0,45 1,05 1,90 2,50
0,80 1,75 3,15 4,15
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USA:
MACHEREY-NAGEL Inc.
2850 Emrick Boulevard · Bethlehem, PA 18020 · USA
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