Herunterladen Inhalt Inhalt
Teilen
Diese Seite drucken
  1. Anleitungen
  2. Marken
  3. illumina Anleitungen
  4. Messgeräte
  5. HiSeq 2000
  6. Systemhandbuch

illumina HiSeq 2000 Systemhandbuch

Vorschau ausblenden Andere Handbücher für HiSeq 2000:
Inhaltsverzeichnis

Werbung

Quicklinks

Diese Anleitung herunterladen
HiSeq 2000
Systemhandbuch
Dokument-Nr. 15011190 v02 DEU
März 2018
Nur für Forschungszwecke.
Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
ILLUMINA – EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT

Werbung

Inhaltsverzeichnis
loading

Verwandte Anleitungen für illumina HiSeq 2000

Inhaltszusammenfassung für illumina HiSeq 2000

  • Seite 1 HiSeq 2000 Systemhandbuch Dokument-Nr. 15011190 v02 DEU ILLUMINA – EIGENTUMSRECHTLICH GESCHÜTZT März 2018 Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
  • Seite 2 Produkts (der hier beschriebenen Produkte) und für keinen anderen Bestimmungszweck ausgelegt. Dieses Handbuch und dessen Inhalt dürfen ohne schriftliches Einverständnis von Illumina nicht verwendet und zu keinem anderen Zweck verteilt bzw. anderweitig übermittelt, offengelegt oder auf irgendeine Weise reproduziert werden. Illumina überträgt mit diesem Dokument keine Lizenzen unter seinem Patent, Markenzeichen, Urheberrecht oder bürgerlichen...
  • Seite 3 Clustergerät hinzugefügt. Custom Protocol Selector wurde zu „Weitere Ressourcen“ hinzugefügt. Nr. 15011190 v02 2018 Informationen über den Überwachungsdienst Illumina Proactive wurden in den Abschnitt „Anzeigen und Senden von Gerätedaten“ aufgenommen. Anmerkung zur ungefähren Häufigkeit des Auswechselns von Waschflaschen und Röhrchen wurde hinzugefügt.
  • Seite 4 HiSeq 2000 Systemhandbuch Dokument Datum Beschreibung der Änderung Teile-Nr. 15011190 November Anweisungen zur Reagenzienvorbereitung wurden entfernt. Anweisungen Rev. T 2013 zur Reagenzienvorbereitung und Informationen über die verschiedenen Sequenzierungs-Primer finden Sie in der Dokumentation zu dem entsprechenden Kit. Teile-Nr. 15011190 Folgende Reagenzien wurden ersetzt: •...
  • Seite 5 HiSeq 2000 Systemhandbuch Dokument Datum Beschreibung der Änderung Teile-Nr. 15011190 April Software-Beschreibungen wurden auf HCS v1.4 aktualisiert. Folgende Informationen wurden hinzugefügt: Rev. G 2011 • Beschreibung der Prüfung der Fließzellenausrichtung • Geschätzte Laufzeiten für HCS v1.4 • Versionskompatibilität der Software- und Reagenzien-Kit-Versionen für verschiedene Fließzellentypen...

  • Seite 6: Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis Versionshistorie Kapitel 1 Überblick Einleitung Weitere Ressourcen Gerätekomponenten Überblick über die Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien Kapitel 2 Erste Schritte Starten des HiSeq 2000-Systems Anpassen der Systemeinstellungen Anzeigen und Senden von Gerätedaten Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Kapitel 3 Sequenzierung im HiSeq v4-Modus Einleitung HiSeq v4-Sequenzierungsworkflow Vorbereiten der Reagenzien Eingeben von Laufparametern Laden und Vorfüllen von Reagenzien...
  • Seite 7 HiSeq 2000 Systemhandbuch Anhang A Fehlerbehebung Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration Durchführen einer Fluidikprüfung BaseSpace ist nicht verfügbar Anhalten und Fortsetzen eines Laufs Unterbrechen eines Laufs Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B Aufteilen von SBS-Kits Primer-Rehybridisierung Anhang B Echtzeitanalyse Überblick über die Echtzeitanalyse Echtzeitanalyse-Workflow Überwachen der Laufkennzahlen...

  • Seite 8: Kapitel 1 Überblick

    Bildgebung von zwei Oberflächen: Das HiSeq 2000 verwendet ein Epifluoreszenzsystem mit vier Kameras und moderner Scan-Technologie, das die Darstellung von zwei Oberflächen ermöglicht. Zwei Fließzellen: Das HiSeq 2000 ist ein System für zwei Fließzellen, das die Durchführung von Sequenzierungen für eine oder beide Fließzellen gleichzeitig und mit unterschiedlichen Read-Längen ermöglicht.

  • Seite 9: Weitere Ressourcen

    Bibliotheken für einen Sequenzierungslauf sowie zum Vorbereiten einer PhiX-Kontrolle. Dieser Schritt gilt für die meisten Bibliothekstypen. Auf der Supportseite für das HiSeq 2000-System auf der Illumina-Website können Sie auf Dokumentation, Software-Downloads, Online-Schulungen und häufig gestellte Fragen zugreifen. Gerätekomponenten Das HiSeq 2000-System besteht aus dem Gerät, dem Bildschirm, dem Gerätesteuerungscomputer und Zubehör wie einer Tastatur, einer Maus und einem Barcodescanner.

  • Seite 10: Fließzellenkammer

    HiSeq 2000 Systemhandbuch B Fließzellenkammer: Enthält den vakuumgesteuerten Fließzellentisch, der die Fließzelle während des Sequenzierungslaufs in Position hält. C Fluidikkammer: Enthält Fluidikpumpen, die die Reagenzien in die Fließzelle und anschließend in den Abfallbehälter leiten. D Statusleiste: Zeigt den Gerätestatus anhand von drei Farben an. Blau bedeutet, dass das Gerät läuft, Orange weist darauf hin, dass das Gerät überprüft werden muss, und Grün zeigt an, dass das Gerät für den...
  • Seite 11 HiSeq 2000-Software Auf dem Gerätecomputer sind drei Software-Anwendungen installiert: HiSeq 2000-Steuerungssoftware: Die Benutzeroberfläche der HiSeq Control Software (HCS) führt Sie durch die Schritte für die Konfiguration eines Sequenzierungslaufs. Während des Laufs steuert die Software die Geräte-Hardware und die Fluidik, legt Temperaturen fest und liefert eine visuelle Zusammenfassung von Qualitätsstatistikwerten.

  • Seite 12: Statussymbole

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Statussymbole In der oberen rechten Ecke jedes Bildschirms befindet sich ein Statussymbol, das Sie über Änderungen der Bedingungen und über Fehler oder Warnungen informiert, die während der Laufkonfiguration und des Laufs auftreten. Statussymbol Statusname Beschreibung Status okay Keine Änderung.

  • Seite 13: Verfügbarer Speicherplatz

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Verfügbarer Speicherplatz Der HiSeq-Gerätecomputer verfügt über eine Speicherkapazität von mehr als 2,7 TB pro Fließzelle. Die Daten von Fließzelle A werden auf Laufwerk D: und die Daten von Fließzelle B werden auf Laufwerk E: gespeichert. Am Ende jedes Bildgebungszyklus für eine Lane überprüft die Software den verfügbaren Speicherplatz auf den lokalen Laufwerken D: und E:.

  • Seite 14: Sequenzierungs-Primer Für Nextera-Bibliotheken

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Sequenzierungs-Primer für Nextera-Bibliotheken Der Index 1-Sequenzierungs-Primer (HP8) und der Read 2-Sequenzierungs-Primer (HP7), die in den TruSeq v3-Cluster-Kits enthalten sind, sind nicht mit Nextera-Bibliotheken kompatibel. Verwenden Sie beim Sequenzieren von Nextera-Bibliotheken den Index 1-Sequenzierungs-Primer (HP14) und den Read 2- Sequenzierungs-Primer (HP11), die in der TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box enthalten sind.

  • Seite 15: Kapitel 2 Erste Schritte

    Kapitel 2 Erste Schritte Starten des HiSeq 2000-Systems Anpassen der Systemeinstellungen Anzeigen und Senden von Gerätedaten Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Starten des HiSeq 2000-Systems Starten Sie den Gerätesteuerungscomputer. Warten Sie, bis das System geladen ist, und melden Sie sich dann beim Betriebssystem an. Fragen Sie, falls erforderlich, den Administrator Ihres Unternehmens nach dem Benutzernamen und dem Kennwort.

  • Seite 16: Anpassen Der Systemeinstellungen

    Voreinstellungen. Das Fenster „Menu Options“ (Menüoptionen) enthält Einstellungen, mit denen die Lauf-ID- Vorlage, die Standardspeicherorte der Ordner und die LIMS-Authentifizierung festgelegt werden können. Außerdem können Sie angeben, ob die Gerätestatusinformationen an Illumina übermittelt werden sollen oder nicht. Um die Benutzeroberfläche der Steuerungssoftware anzupassen, wählen Sie Menu | View (Menü | Ansicht).

  • Seite 17: Festlegen Der Lims-Voreinstellungen

    Daten werden das Erkennen möglicher Fehler und die Fehlerbehebung durch Illumina unterstützt, sodass durch proaktive Wartung die Geräteverfügbarkeit maximiert werden kann. Weitere Informationen zu den Vorteilen dieses Services finden Sie im technischen Hinweis zu Illumina Proactive (Dokument- Nr. 1000000052503). Dieser Dienst: Sendet keine Sequenzierungsdaten.

  • Seite 18: Vom Benutzer Bereitzustellende Verbrauchsmaterialien

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Vom Benutzer bereitzustellende Verbrauchsmaterialien Verbrauchsmaterial Anbieter Zweck Alkoholtupfer, 70 % Isopropyl VWR, Katalog-Nr. 95041-714 Reinigen der Fließzelle und des oder Allgemeiner Laborlieferant Fließzellentisches. Ethanol, 70 % Ballonflasche, Fassungsvermögen Allgemeiner Laborlieferant Vorbereitung der Lösung für den mindestens 6 Liter Wartungswaschlauf. 250-ml-Zentrifugenröhrchen Corning, Katalog-Nr. 430776 SBS-Reagenzien-Racks, Positionen mit PW1.

  • Seite 19: Kapitel 3 Sequenzierung Im Hiseq V4-Modus

    Durchführen eines Wasserwaschlaufs Einleitung Für die Durchführung eines Sequenzierungslaufs auf dem HiSeq 2000 im HiSeq v4-Modus bereiten Sie alle Reagenzien vor und halten Sie sich an die Eingabeaufforderungen für die Laufkonfiguration. Zu den Schritten für das Konfigurieren des Laufs gehören das Eingeben der Laufparameter, das Laden und Vorfüllen der Reagenzien, das Laden der Fließzelle und das Durchführen einer Fluidikprüfung.

  • Seite 20: Hiseq V4-Sequenzierungsworkflow

    HiSeq 2000 Systemhandbuch HiSeq v4-Sequenzierungsworkflow Bereiten Sie alle Reagenzien für den Lauf vor. Geben Sie die Laufparameter ein. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, laden Sie alle Reagenzien für den Lauf: • Laden Sie die SBS-Reagenzien für Read 1 und Read 2.

  • Seite 21: Vorbereiten Von Sbs-Reagenzien

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Vorbereiten von SBS-Reagenzien SBS-Reagenzien werden zu Beginn des Laufs auf das Gerät geladen. Gehen Sie zum Vorbereiten der Reagenzien wie nachfolgend beschrieben vor, um die SBS-Reagenzien aufzutauen. Auftauen von SBS-Reagenzien Nehmen Sie CRM, IRM und USM aus dem -25 °C bis -15 °C kalten Lagerort. Schirmen Sie IRM vom Umgebungslicht ab.

  • Seite 22: Vorbereiten Von Hp9

    Entsorgen Sie sie daher gemäß den geltenden regionalen, nationalen und lokalen Gesetzen und Vorschriften. Zusätzliche umwelt-, gesundheits- und sicherheitsbezogene Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt (SDS, Safety Data Sheet) unter support.illumina.com/sds.html. Auftauen von Paired-End-Reagenzien Nehmen Sie die folgenden Reagenzien aus dem Lagerort mit einer Temperatur von -25 °C bis -15 °C heraus: Für nicht indizierte Läufe: AMS, FDR, FLM2, FPM, FRM und HP11...

  • Seite 23: Eingeben Von Laufparametern

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Eingeben von Laufparametern Starten Sie die Laufkonfiguration, indem Sie Laufparameter für eine Reihe von Bildschirmen auf der Registerkarte „Run Configuration“ (Laufkonfiguration) eingeben. Die Software führt Sie durch jeden Bildschirm, wenn Sie die BaseSpace Sequence Hub-Konnektivität angeben, Verbrauchsmaterial-IDs eintragen, Indizierungsoptionen auswählen und weitere Parameter angeben.
  • Seite 24 HiSeq 2000 Systemhandbuch Save Tile Thumbnails (Platten-Miniaturbilder speichern): Speichert die Platten-Miniaturbilder. Platten- Miniaturbilder stellen keine Auswahl von Platten in einem Bildstreifen dar, sondern eine einzelne Platte. Wählen Sie Next (Weiter). Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Konfiguration der Fließzelle) Im Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Konfiguration der Fließzelle) werden Informationen über die Fließzelle aufgezeichnet, die für Ihren Lauf verwendet wird.
  • Seite 25 HiSeq 2000 Systemhandbuch Die Anzahl der in einem Read ausgeführten Zyklen ist um einen Zyklus höher als die Anzahl der analysierten Zyklen. Wenn Sie beispielsweise 125 Zyklen für Read 1 durchführen möchten, geben Sie 126 ein. Geben Sie für die Indizierungsoption Custom (Benutzerdefiniert) die Anzahl der Zyklen für die Index- Reads ein.

  • Seite 26: Überprüfungsbildschirm

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Überprüfungsbildschirm Überprüfen Sie die Laufparameter auf dem Überprüfungsbildschirm. Wählen Sie Next (Weiter), um fortzufahren, bzw. Back (Zurück), um Parameter zu ändern. Laden und Vorfüllen von Reagenzien Nach der Eingabe der Laufparameter sind die nächsten Schritte für die Laufkonfiguration das Laden der SBS-, Indizierungs- und Paired-End-Reagenzien sowie das Vorfüllen der Reagenzien durch das...

  • Seite 27: Laden Von Indizierungsreagenzien

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Schieben Sie das Reagenzien-Rack in die Reagenzienkammer. Richten Sie das Rack an der erhöhten Führungsschiene unten in der Kammer aus. Senken Sie die Sipper wie folgt in die SBS-Reagenzienflaschen ab: Ziehen Sie den Sipper-Griff zu sich hin und drücken Sie ihn dann nach unten.

  • Seite 28: Laden Von Paired-End-Reagenzien

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Senken Sie die Sipper wie folgt in die Paired-End-Reagenzröhrchen ab: Ziehen Sie den Griff zu sich hin und senken Sie ihn ab. b Inspizieren Sie die Sipper, um sicherzustellen, dass sie beim Eintauchen in die Röhrchen nicht verbogen werden.

  • Seite 29: Laden Der Primer-Fließzelle

    HiSeq 2000 Systemhandbuch VORSICHT Verwenden Sie immer eine gebrauchte Fließzelle zum Vorfüllen von Reagenzien. Sie können die Fließzelle aus dem vorherigen Lauf verwenden, um die Reagenzien des nachfolgenden Laufs vorzufüllen oder einen Nachwaschlauf durchzuführen. Laden der Primer-Fließzelle Spülen Sie die Primer-Fließzelle mit Wasser in Laborqualität. Trocknen Sie sie mit einem Reinigungstuch für Objektive oder einem anderen fusselfreien Tuch ab.

  • Seite 30: Positionieren Der Röhrchen Und Starten Des Vorfüllvorgangs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Scannen Sie die Primer-Fließzellen-ID (Barcodenummer) der Primer-Fließzelle ein oder geben Sie sie ein. Wählen Sie Position 2 aus der Dropdown-Liste aus. Überprüfen Sie die folgenden Standardwerte: Volume (Volumen): 125 Aspirate Rate (Aspirationsrate): 250 Dispense Rate (Zufuhrrate): 2.000 Wählen Sie Pump (Pumpe).

  • Seite 31: Einsetzen Der Sequenzierungsfließzelle

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Legen Sie die Abfallröhrchen zurück in den Abfallbehälter. Wählen Sie Next (Weiter). Einsetzen der Sequenzierungsfließzelle Das Einsetzen der Fließzelle für die Sequenzierung umfasst das Entfernen der Primer-Fließzelle, das Reinigen des Fließzellenhalters, das Einsetzen der Cluster-Fließzelle sowie das Verifizieren des ordnungsgemäßen Flusses.
  • Seite 32 HiSeq 2000 Systemhandbuch Halten Sie mit zwei Fingern die Fließzelle an den Kanten und achten Sie darauf, dass die Einlass- und Auslassanschlüsse nach oben weisen. Reinigen Sie die beiden Seiten der Fließzelle jeweils mit einer einzigen Wischbewegung. Falten Sie den Alkoholtupfer nach jedem Wischen neu und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Fließzelle gereinigt ist.
  • Seite 33 HiSeq 2000 Systemhandbuch Prüfen des Flusses Bei der Überprüfung des Flusses wird auch festgestellt, ob die Fließzelle und die Dichtungen ordnungsgemäß installiert sind und ein Vakuum entstanden ist. Wählen Sie Position 5 aus der Dropdown-Liste aus. Überprüfen Sie die folgenden Standardwerte:...

  • Seite 34: Überwachen Des Laufs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Überwachen des Laufs Sie können die Laufkennzahlen auf dem Laufübersichtsbildschirm überwachen. Abbildung 10 Laufübersichtsbildschirm A Statusleiste: In der Statusleiste können Sie prüfen, wie viele Zyklen bereits abgeschlossen sind. B Fluidikdiagramm: Erweitern Sie den Fluidikabschnitt und überwachen Sie die chemischen Schritte.

  • Seite 35: Durchführen Eines Wasserwaschlaufs

    Lauf. Anweisungen finden Sie unter Durchführen eines Wartungswaschlaufs auf Seite 53. Anweisungen finden Sie im Handbuch zum HiSeq 2000-System (Dokument-Nr. 15011190). Wenn das Gerät einen Tag oder länger nicht verwendet wurde, führen Sie einen Wasserwaschlauf durch, bevor Sie einen neuen Sequenzierungslauf starten.
  • Seite 36 HiSeq 2000 Systemhandbuch Bündeln Sie die Abfallröhrchen mit Parafilm. Achten Sie darauf, dass die Enden nebeneinanderliegen. Platzieren Sie die gebündelten Enden der Röhrchen in eine 250-ml-Flasche. 10 Wählen Sie Next (Weiter), um den Wasserwaschlauf zu starten. Positionen Ungefähre Laufzeit Acht SBS-Positionen 20 Minuten...

  • Seite 37: Kapitel 4 Sequenzierung Im Truseq V3-Modus

    Durchführen eines Wasserwaschlaufs Einleitung Für die Durchführung eines Sequenzierungslaufs auf dem HiSeq 2000 im TruSeq v3-Modus bereiten Sie SBS- Reagenzien für Read 1 und Indizierungsreagenzien vor, bevor Sie den Lauf konfigurieren. Folgen Sie den Anweisungen der Software, um den Lauf zu konfigurieren. Die Laufkonfiguration umfasst das Eingeben der Laufparameter, das Laden und Vorfüllen der Reagenzien, das Einsetzen der Fließzelle und die Fluidikprüfung.

  • Seite 38: Truseq V3-Sequenzierungsworkflow

    HiSeq 2000 Systemhandbuch TruSeq v3-Sequenzierungsworkflow Bereiten Sie SBS-Reagenzien für Read 1 und Indizierungsreagenzien vor. Geben Sie mithilfe der Steuerungssoftware die Laufparameter ein. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, laden Sie alle SBS-Reagenzien für Read 1: • Laden Sie die SBS-Reagenzien für Read 2, außer ICB.

  • Seite 39: Vorbereiten Von Reagenzien Für Read 1

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Vorbereiten von Reagenzien für Read 1 Bereiten Sie vor der Konfiguration des Laufs die Reagenzien für Read 1 und die Index-Reads vor. Laden Sie die vorbereiteten Reagenzien, wenn Sie von der Steuerungssoftware dazu aufgefordert werden. Die Reagenzien für Read 1 können während der Clusterbildung vorbereitet werden. Anweisungen für die Vorbereitung der Cluster-Reagenzien und die Durchführung der Clusterbildung finden Sie im Handbuch zum...
  • Seite 40 HiSeq 2000 Systemhandbuch Nehmen Sie LFN aus dem -25 °C bis -15 °C kalten Lagerort heraus: 50-Zyklen-SBS-Kit: Nehmen Sie ein Röhrchen heraus. 200-Zyklen-SBS-Kit: Nehmen Sie zwei Röhrchen heraus. Lassen Sie LFN in einem Becher mit raumtemperiertem deionisiertem Wasser etwa 20 Minuten lang auftauen. Verwenden Sie ICB, SB1, SB2 und SB3 direkt aus einem bei 2 °C bis 8 °C gekühlten Lagerort.
  • Seite 41 HiSeq 2000 Systemhandbuch Geben Sie das gemessene LFN-Volumen in die neue Flasche mit ICB. Spülen Sie die beiden LFN-Röhrchen mit ICB, um sicherzustellen, dass der gesamte LFN-Inhalt übertragen wurde. Geben Sie das gemessene EDP-Volumen in die Lösung mit ICB und LFN. Spülen Sie das EDP-Röhrchen mit der ICB-LFN-Lösung, um sicherzustellen, dass der gesamte EDP- Inhalt übertragen wurde.

  • Seite 42: Vorbereiten Von Hp2

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Für doppelt indizierte Läufe auf einer Paired-End-Fließzelle: RMR Lassen Sie die Reagenzien in einem Becher mit raumtemperiertem deionisiertem Wasser etwa 20 Minuten lang auftauen. Vorbereiten von HP2 Invertieren Sie zum Mischen. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1.000 rpm.
  • Seite 43 HiSeq 2000 Systemhandbuch Bildschirm „Integration“ Der Bildschirm „Integration“ ermöglicht Ihnen, den Lauf mit BaseSpace Sequence Hub zu verbinden. Wählen Sie im Begrüßungsbildschirm Sequence | New Run (Sequenzieren | Neuer Lauf), um den Bildschirm „Integration“ zu öffnen. [Optional] Stellen Sie wie folgt eine Verbindung zu BaseSpace Sequence Hub her.
  • Seite 44 HiSeq 2000 Systemhandbuch Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Konfiguration der Fließzelle) Im Bildschirm „Flow Cell Setup“ (Konfiguration der Fließzelle) werden Informationen über die Fließzelle aufgezeichnet, die für Ihren Lauf verwendet wird. Scannen Sie die Fließzellen-ID (Barcodenummer) der zu sequenzierenden Fließzelle ein oder geben Sie sie ein.
  • Seite 45 HiSeq 2000 Systemhandbuch Geben Sie die Anzahl der Zyklen für Read 1 und ggf. Read 2 ein. Die Anzahl der in einem Read ausgeführten Zyklen ist um einen Zyklus höher als die Anzahl der analysierten Zyklen. Wenn Sie beispielsweise 125 Zyklen für Read 1 durchführen möchten, geben Sie 126 ein.

  • Seite 46: Laden Und Vorfüllen Von Reagenzien

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Wählen Sie Prime SBS Reagents (SBS-Reagenzien vorfüllen), um die Reagenzien vorzufüllen. Wählen Sie Next (Weiter). Überprüfungsbildschirm Überprüfen Sie die Laufparameter auf dem Überprüfungsbildschirm. Wählen Sie Next (Weiter), um fortzufahren, bzw. Back (Zurück), um Parameter zu ändern. Laden und Vorfüllen von Reagenzien Nach der Eingabe der Laufparameter sind die nächsten Schritte für die Laufkonfiguration das Laden der...
  • Seite 47 HiSeq 2000 Systemhandbuch Senken Sie die Sipper wie folgt in die SBS-Reagenzienflaschen ab: Ziehen Sie den Sipper-Griff zu sich hin und drücken Sie ihn dann nach unten. b Inspizieren Sie die Sipper, um sicherzustellen, dass sie beim Eintauchen in die Trichterverschlüsse nicht verbogen werden.
  • Seite 48 HiSeq 2000 Systemhandbuch Senken Sie die Sipper wie folgt in die Paired-End-Reagenzröhrchen ab: Ziehen Sie den Griff zu sich hin und senken Sie ihn ab. b Inspizieren Sie die Sipper, um sicherzustellen, dass sie beim Eintauchen in die Röhrchen nicht verbogen werden.
  • Seite 49 HiSeq 2000 Systemhandbuch Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 1. Dadurch wird das Vakuum aktiviert und die Fließzelle wird gesichert. Wenn der Fließzellenregler grün blinkt, ist das Vakuum aktiviert. Falls der Regler nicht grün leuchtet, lesen Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration auf Seite Warten Sie etwa fünf Sekunden und bewegen Sie dann den Fließzellenregler langsam in Position 2.

  • Seite 50: Einsetzen Der Sequenzierungsfließzelle

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Positionieren der Röhrchen und Starten des Vorfüllvorgangs Entfernen Sie die acht Abfallröhrchen der entsprechenden Fließzelle vom Abfallbehälter. Abbildung 13 Positionieren der Röhrchen bzw. Schläuche A Abfallröhrchen der Fließzelle für die Reagenzienpositionen 1–8 B Schlauch der Kondensatpumpe C Schlauch der Paired-End-Vorfüllpumpe Platzieren Sie jedes Abfallröhrchen in einem separaten leeren 15-ml-Röhrchen.
  • Seite 51 HiSeq 2000 Systemhandbuch Reinigen des Fließzellenhalters Ziehen Sie ein neues Paar ungepuderte Latexhandschuhe an. Wischen Sie die Oberfläche des Fließzellenhalters mit einem mit Wasser in Laborqualität befeuchteten, fusselfreien Tuch ab, um Salzablagerungen zu entfernen. Wischen Sie die Oberfläche des Fließzellenhalters mit einem Alkoholtupfer oder einem fusselfreien, mit Ethanol oder Isopropanol befeuchteten Tuch ab.
  • Seite 52 HiSeq 2000 Systemhandbuch Abbildung 15 Fließzelle an oberem und rechten Führungsstiften ausgerichtet A Oberer Führungsstift B Rechte Führungsstifte Nehmen Sie die Hand von der Fließzelle, um zu verhindern, dass im Laufe der Zeit eine Verschiebung der Ausrichtung auftritt. Bewegen Sie den Fließzellenregler langsam in Position 1. Dadurch wird das Vakuum aktiviert und die Fließzelle wird gesichert.
  • Seite 53 HiSeq 2000 Systemhandbuch Prüfen des Flusses Bei der Überprüfung des Flusses wird auch festgestellt, ob die Fließzelle und die Dichtungen ordnungsgemäß installiert sind und ein Vakuum entstanden ist. Wählen Sie Position 5 aus der Dropdown-Liste aus. Überprüfen Sie die folgenden Standardwerte:...

  • Seite 54: Überwachen Des Laufs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Überwachen des Laufs Sie können die Laufkennzahlen auf dem Laufübersichtsbildschirm überwachen. Abbildung 16 Laufübersichtsbildschirm A Statusleiste: In der Statusleiste können Sie prüfen, wie viele Zyklen bereits abgeschlossen sind. B Fluidikdiagramm: Erweitern Sie den Fluidikabschnitt und überwachen Sie die chemischen Schritte.

  • Seite 55: Vorbereiten Von Icb Für Read 2 (Kein Index Oder Einfacher Index)

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Vorbereiten von Paired-End-Reagenzien Paired-End-Reagenzien werden während des Read 2-Resynthese-Vorgangs eines Paired-End- Sequenzierungslaufs verwendet. HINWEIS Nextera-Bibliotheken erfordern HP11, einen Sequenzierungs-Primer der TruSeq Dual Index Sequencing Primer Box. Alle anderen Bibliotheken verwenden HP7. Auftauen von Paired-End-Reagenzien Nehmen Sie die folgenden Reagenzien aus dem Lagerort mit einer Temperatur von -25 °C bis -15 °C heraus: Für nicht indizierte oder einfach indizierte Läufe: AMX2, APM2, AT2, BMX, HP3, HP7 oder HP11,...

  • Seite 56: Vorbereiten Von Icb Für Read 2 (Doppelter Index)

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Wenn die Reagenzien aufgetaut sind, geben Sie den Inhalt der beiden LFN-Röhrchen in die Flasche mit 47 ml ICB. Spülen Sie die beiden LFN-Röhrchen mit ICB, um sicherzustellen, dass der gesamte LFN-Inhalt übertragen wurde. Geben Sie 1,1 ml EDP zur ICB-LFN-Lösung hinzu.

  • Seite 57: Laden Von Icb Für Read

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Nehmen Sie die Verschlüsse der einzelnen Reagenzröhrchen ab. Stellen Sie die einzelnen Röhrchen in die entsprechenden nummerierten Positionen des Racks. Tabelle 9 Positionen der Paired-End-Reagenzien Position Reagenz Beschreibung Resynthese-Mischung LMX2 Linearisierungsmischung 2 Blockiermischung AMX2 Amplifikationsmischung 2 APM2...

  • Seite 58: Entladen Von Reagenzien

    Lauf. Anweisungen finden Sie unter Durchführen eines Wartungswaschlaufs auf Seite 53. Anweisungen finden Sie im Handbuch zum HiSeq 2000-System (Dokument-Nr. 15011190). Wenn das Gerät einen Tag oder länger nicht verwendet wurde, führen Sie einen Wasserwaschlauf durch, bevor Sie einen neuen Sequenzierungslauf starten.
  • Seite 59 HiSeq 2000 Systemhandbuch Führen Sie eine Fluidikprüfung durch: Wählen Sie Lösung 2 aus der Dropdown-Liste aus. b Akzeptieren Sie die Standardwerte für die Pumpe. Wählen Sie Pump (Pumpe). d Inspizieren Sie die Fließzelle auf Luftblasen, die die Lanes passieren, sowie auf Undichtigkeiten in der Nähe der Manifolds.

  • Seite 60: Kapitel 5 Wartung

    Präventive Wartung Illumina empfiehlt, jährlich eine präventive Wartung durchführen zu lassen. Wenn Sie keinen Servicevertrag abgeschlossen haben, wenden Sie sich an den für Ihre Region zuständigen Kundenbetreuer oder an den technischen Support von Illumina, um einen Termin für eine kostenpflichtige präventive Wartung zu vereinbaren.

  • Seite 61: Tween 20 Und Proclin 300

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Fügen Sie zuerst das Wasser hinzu und kombinieren Sie die folgenden Volumina in der Ballonflasche: Wasser in Laborqualität (750 ml) 10 % Tween 20 (250 ml) ProClin 300 (1,5 ml) Diese Volumina ergeben eine Lösung aus ca. 2,5 % Tween 20 und 0,15 % ProClin 300. Stellen Sie die Flasche auf eine Rührplatte und mischen Sie gründlich.
  • Seite 62 HiSeq 2000 Systemhandbuch Abbildung 17 Entfernen der gebrauchten Manifold-Dichtungen 12 Legen Sie eine neue Dichtung mit acht Anschlüssen in jede Aussparung vorne und hinten am Fließzellenhalter. Drücken Sie die Dichtungen leicht nach unten. 13 Laden Sie die Fließzelle neu, die Sie zum Einsetzen der neuen Dichtungen entfernt hatten.

  • Seite 63: Versetzen Des Geräts In Den Leerlauf

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Versetzen des Geräts in den Leerlauf Gehen Sie wie nachfolgend beschrieben vor, wenn das Gerät bis zu 10 Tage im Leerlaufmodus bleiben soll. Falls das Gerät länger als 10 Tage nicht verwendet werden soll, schalten Sie es stattdessen aus.

  • Seite 64: Anhang A Fehlerbehebung

    Anhang A Fehlerbehebung Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration Durchführen einer Fluidikprüfung BaseSpace ist nicht verfügbar Anhalten und Fortsetzen eines Laufs Unterbrechen eines Laufs Gestaffelte Läufe auf Fließzelle A und Fließzelle B Aufteilen von SBS-Kits Primer-Rehybridisierung Mögliche Probleme bei der Laufkonfiguration Problem Mögliche Ursache Aktion Die Software wurde nicht Die Software konnte interne...

  • Seite 65: Durchführen Einer Fluidikprüfung

    Wenn BaseSpace nicht verfügbar ist, öffnen Sie die Windows-Dienste und vergewissern Sie sich, dass der BaseSpace Broker gestartet wurde. Ist dies nicht der Fall, starten Sie den Dienst. Wenn Dienste laufen, BaseSpace aber dennoch nicht verfügbar ist, wenden Sie sich an den technischen Support von Illumina. Anhalten und Fortsetzen eines Laufs Es kann erforderlich sein, einen Lauf anzuhalten, wenn er falsch konfiguriert wurde, wenn die Datenqualität...

  • Seite 66: Anhalten Eines Laufs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Stopp-Option RTA-Option Fortsetzen möglich? Normal Stop (End of Keep As Is (Ohne Ja. Der Lauf wird mit dem nächsten Chemie- oder Lane\Chemistry) Änderungen Bildgebungsbefehl fortgesetzt. (Regulärer Stoppvorgang fortfahren) [Lane-/Chemie-Ende]) Complete For Run (Für Nein. Der Lauf kann nicht fortgesetzt werden.

  • Seite 67: Fortsetzen Eines Angehaltenen Laufs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Complete For Read (Für Read beenden): Die Echtzeitanalyse wird gestoppt. Die Laufdaten, Laufparameter und Rezepturdateien werden aktualisiert, um die Länge des aktuellen Reads auf den zuletzt durchgeführten Zyklus zu kürzen. Die nachfolgenden Reads sind nicht davon betroffen.

  • Seite 68: Unterbrechen Eines Laufs

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Da der Lauf in diesem Beispiel während eines Bildgebungsschrittes angehalten wurde, wird automatisch Imaging (no chemistry) (Bildgebung [keine Chemie]) ausgewählt. Unterbrechen eines Laufs Das Unterbrechen eines Laufs ist möglich, um ggf. die Laufkomponenten, z. B. die Reagenzienmengen, zu prüfen.

  • Seite 69: Aufteilen Von Sbs-Kits

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Nachdem Sie die Sequenzierungsfließzelle für den neuen Lauf geladen haben, schließen Sie die Tür der Fließzellenkammer. Wählen Sie Start, um den Sequenzierungslauf zu starten. Aufteilen von SBS-Kits Zur Durchführung eines Paired-End-Laufs, der kürzer als 125 Zyklen pro Read ist, teilen Sie ein HiSeq v4-Kit für 250 Zyklen in zwei Reagenziensätze auf.

  • Seite 70: Aufteilen Eines Kits Für 200 Zyklen

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Aufteilen eines Kits für 200 Zyklen Tauen Sie die Reagenzien aus dem TruSeq v3 SBS-Kit (200 Zyklen) auf. Siehe Auftauen von SBS- Reagenzien auf Seite Kennzeichnen Sie sieben 250-ml-Flaschen mit der Positionsnummer und dem Reagenziennamen wie folgt: Nr. 1 ICB Nr.

  • Seite 71: Primer-Rehybridisierung

    Rehybridisierung durch, um die Fließzelle zu retten. Die Primer-Rehybridisierung beschädigt nicht die Cluster. HiSeq v4-Fließzelle Alle Rehybridisierungsschritte werden auf dem HiSeq 2000 durchgeführt. Das Kit enthält Primer für Read 1, Index-1-Read, Index-2-Read für Single-Read-Fließzellen und Read 2. Name des Rehybridisierungskits...

  • Seite 72: Anhang B Echtzeitanalyse

    Anhang B Echtzeitanalyse Überblick über die Echtzeitanalyse Echtzeitanalyse-Workflow Überwachen der Laufkennzahlen Überblick über die Echtzeitanalyse Die Echtzeitanalyse (Real-Time Analysis, RTA) wird auf dem Gerätecomputer ausgeführt. Sie führt das Base- Calling durch und weist jedem Base-Call einen Qualitäts-Score zu. Die Software prüft den Status jeder Platte und ermittelt, wann der nächste Verarbeitungsschritt für die entsprechende Platte durchgeführt werden kann.

  • Seite 73: Fehlerbehandlung

    HiSeq 2000 Systemhandbuch RTA liefert Echtzeitkennzahlen zur Laufqualität, die in InterOp-Dateien gespeichert werden. InterOp-Dateien sind Binärdateien mit Kennzahlen zu Platten, Zyklen und zur Read-Ebene. Sie werden benötigt, um Kennzahlen im Sequenzierungsanalyse-Viewer (SAV) ansehen zu können. Verwenden Sie zur Anzeige der von RTA generierten Kennzahlen SAV v1.8.20 oder höher.

  • Seite 74: Registrierung Und Intensitätsextraktion

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Registrierung und Intensitätsextraktion Die Registrierung und die Intensitätsextraktion werden durchgeführt, nachdem die Matrize mit den Clusterpositionen erstellt wurde. Bei der Registrierung werden die Bilder, die bei jedem weiteren Zyklus der Matrizenbildung erzeugt werden, an der Matrize ausgerichtet.

  • Seite 75: Cluster Nach Filterung

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Beim Base-Calling wird eine Base (A, C, G oder T) für jeden Cluster einer bestimmten Platte eines bestimmten Zyklus festgelegt. Base-Calls werden in Base-Call-Dateien (*.bcl) gespeichert. Base-Call- Dateien sind Binärdateien mit 1 Byte pro Call und Qualitäts-Score. Jede Base-Call-Datei enthält den Base- Call und den entsprechenden Qualitäts-Score.

  • Seite 76: Überwachen Der Laufkennzahlen

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Die Q-Score-Gruppierung trägt zur Effizienz der Analyseverfahren und Datenübertragungsanforderungen bei, die mit dem hohen Durchsatz des HiSeq 2000 einhergehen. Die resultierende *.bcl-Datei ist kleiner, da die Komprimierungsalgorithmen die Datei besser komprimieren können. Es werden weniger Daten auf den Gerätecomputer geschrieben und auf einen Speicherort im Netzwerk übertragen, wodurch das Kopieren der...

  • Seite 77: Anhang C Ausgabedateien Und -Ordner

    Anhang C Ausgabedateien und -ordner Sequenzierungsausgabedateien Ordnerstruktur der Ausgabedaten Plattennummerierung Miniaturbilder Sequenzierungsausgabedateien Dateityp Dateibeschreibung, Speicherort und Name Base-Call-Dateien Die Analyseergebnisse der einzelnen Platten werden in Base-Call-Dateien gespeichert. Sie enthalten den Base-Call und den kodierten Qualitäts-Score. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X]: Die Dateien für jede Lane werden pro Zyklus in den jeweiligen Ordnern gespeichert.

  • Seite 78: Ordnerstruktur Der Ausgabedaten

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Dateityp Dateibeschreibung, Speicherort und Name Laufinformationsdatei Enthält den Namen des Laufs, die Anzahl der Zyklen in jedem Read, die Angabe, ob der Read indiziert ist, sowie die Anzahl der Bildstreifen und Platten auf der Fließzelle. Die Laufinformationsdatei wird am Anfang des Laufs generiert.

  • Seite 79: Plattennummerierung

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Die Laufnummer wird jedes Mal, wenn das Gerät einen Sequenzierungslauf durchführt, um eins erhöht. Die Fließzellenseite (A oder B) und die Fließzellen-ID, die Sie beim Konfigurieren des Laufs eingegeben haben, werden an das Ende des Laufordnernamens angehängt.

  • Seite 80: Miniaturbilder

    HiSeq 2000 Systemhandbuch Miniaturbilder Sie können die Steuerungssoftware für das Generieren von Miniaturbildern im *.jpg-Format konfigurieren. Miniaturbilder werden für jeden Zyklus und jede Base generiert. Die Steuerungssoftware sammelt Bilder aus neun Abschnitten einer Platte. Die neun Bilder werden in einem Miniaturbild kombiniert und können zur Fehlerbehebung bei einem Lauf verwendet werden.

  • Seite 81: Index

    Durchgeführt vs. Eingegeben 18, 38 HiSeq v4-Chemie 12 Standard 18, 38 Dateispeicherorte 70-71 TruSeq v3-Chemie 30 Daten Aufteilen von ICB 32 An Illumina senden 10 Aufzeichnen von Fließzellen-IDs 17 Illumina Proactive 10 Aufzeichnen von Reagenzien-Kit-IDs 18, 38 Komprimierung 69 Ausgabeordner Nach Zyklus 69...
  • Seite 82 HiSeq 2000 Systemhandbuch Fließzelle Berechnungsbeispiel 34 Bildgebung 72-73 Indizierung Clusterpositionen 66 Anzahl der Zyklen 12, 30 Positionierung 3, 22, 25, 41, 44 Erforderliche Reagenzien 14, 34 Überprüfen 23, 26, 42, 46 Indizierungsreagenzien Vorfüllen 21, 41 HiSeq v4 14 Fließzellen-ID aufzeichnen 17 TruSeq v3 34 Fließzellenregler 3...
  • Seite 83 HiSeq 2000 Systemhandbuch Qualitäts-Scores 68 Überwachen 27, 47 Qualitätstabellen 68 Markerdateien 66 Miniaturbilder 70, 73 Speichern 16, 36 Mögliche Zyklen Racks, Reagenzien 3 HiSeq v4-Chemie 12 Reagenzien TruSeq v3-Chemie 30 Kürzere Läufe 62 Nach dem Lauf 27, 51 Wechsel während des Laufs 61...
  • Seite 84 HiSeq 2000 Systemhandbuch Software Fehlerbehebung 57 Installierte Anwendungen 4 Warnungen Merkmale 1 Beheben 5 Speicherkapazität 6 Beschreibungen 5 Optimierung 16, 36, 69 Wartung, präventive 53 Speichern von Miniaturbildern 16, 36 Wartungswaschläufe Speicherort des Laufordners 71 Abgegebene Volumina 55 Spezifikationen, Leistung 12, 30 Häufigkeit 53...

  • Seite 85: Technische Unterstützung

    Die Produktdokumentation steht auf der Illumina-Website im PDF-Format zum Herunterladen zur Verfügung. Gehen Sie zu support.illumina.com, wählen Sie ein Produkt und wählen Sie anschließend Documentation & Literature (Dokumentation und Literatur). Dokument-Nr. 15011190 v02 DEU Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren.
  • Seite 86 Dokument-Nr. 15011190 v02 DEU Illumina 5200 Illumina Way San Diego, Kalifornien 92122, USA +1.800.809.ILMN (4566) +1.858.202.4566 (außerhalb von Nordamerika) techsupport@illumina.com www.illumina.com Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in Diagnoseverfahren. © 2018 Illumina, Inc. Alle Rechte vorbehalten.

Inhaltsverzeichnis