Merck Millipore Auto2D Plus Schnellstartanleitung Seite 8

Preparación
Reactivos
1. Prepare y conserve los kits de reactivos
como se indica en el prospecto
suministrado con los kits o en el manual
del usuario completo (virtual).
2. Deje que los siguientes productos
conservados a bajas temperaturas se
equilibren a temperatura ambiente
(20–25 °C aproximadamente 10 minutos).
• Chip de IEF
• Chip de PAGE
• Disolución de rehidratación
• Disolución de DTT
• Anfolito
3. Prepare la disolución de rehidratación
de trabajo para la rehidratación del Chip
de IEF y la extracción o dilución de la
muestra proteica:
Concentración
Reactivos Volumen final
Disolución de
189 µl
rehidratación
Disolución de
10 µl 50 mM
DTT
Anfolito* 1–2 µl 0,5–1 % v/v
Total 200 µl
* Seleccione el anfolito de acuerdo
con el intervalo de pH del Chip de IEF
que vaya a utilizar. Para anfolitos
a una concentración madre del 40 %,
añada 1 µl. Para anfolitos a 100X,
añada 2 µl.
4. Prepare el tampón de equilibrio de trabajo
para equilibrar las proteínas separadas
por IEF antes de la separación por
SDS-PAGE.
Concentración
Reactivos Volumen final
Premezcla del
tampón de 760 µl
equilibrio
Disolución de
40 µl 50 mM
DTT
Total 800 µl
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Preparación de la muestra
Disuelva la muestra de proteínas en la
disolución de rehidratación de trabajo
preparada según el paso 3. La muestra
puede diluirse dos veces o más con disolución
de rehidratación de trabajo hasta alcanzar la
concentración de proteínas deseada y disminuir
la concentración de sal.
Una concentración elevada de sal puede
afectar a la separación de proteínas durante
el enfoque isoeléctrico y hacer que la corriente
supere los 100 µA. Las muestras con una
elevada concentración de sal deben ser
desaladas mediante:
Precipitación con ácido tricloroacético (TCA)
o acetona y de suspensión de las proteínas
en disolución de rehidratación de trabajo
O
Cambio de tampón utilizando una columna
de centrifugación
O
Protocolo de desalación utilizando el
dispositivo Auto2D (véase el manual del
®
usuario completo virtual para
más información.)
NOTA: Durante la resuspensión de proteínas,
evite el calentamiento de las proteínas por
encima de 37 °C.
Cuantificación de proteínas. Para la
electroforesis en 2D, pueden cargarse entre
0,1 y 100 µg de proteína. La cantidad óptima
de proteína dependerá del método de detección
y de la complejidad de la muestra. Como punto
de partida deberán utilizarse las siguientes
cantidades de proteínas; los usuarios quizá
tengan que optimizar la cantidad cargada en
función de su muestra concreta.
• Tinción con azul brillante Coomassie: 50 µg
• Tinción fluorescente 10 µg
• Tinción con plata 5 µg
• Premarcaje fluorescente: 3 µg
Utilice la cantidad de proteínas cargada en el
Chip de disoluciones para determinar si deberá
emplearse el tipo de receta S, M o L para la
separación de las proteínas.
El volumen de muestra aplicado al dispositivo
es 13–15 µl. La muestra puede diluirse con
disolución de rehidratación de trabajo
según necesidad.
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Encendido del dispositivo Auto2D
Seleccione el cable de alimentación apropiado
(suministrado con el dispositivo) que sea
compatible con los enchufes de su país. Enchufe
firmemente el extremo correspondiente en la
parte trasera del dispositivo Auto2D
extremo en el enchufe de la luz.
El interruptor de alimentación está situado
cerca del puerto del enchufe de corriente
alterna en la parte trasera del dispositivo
Auto2D . Presione el interruptor hacia arriba
®
para encenderlo.
La aplicación se lanzará automáticamente.
Desde la pantalla, seleccione el modo
Auto2D Plus.
®
Cargar una receta
Elija SETTING > RECIPE (CONFIGURACIÓN >
RECETA). Toque la pantalla de información de
la receta. Aparecerá el cuadro de diálogo de
selección de recetas.
Seleccione "RECIPE NAME" > LOAD > OK >
EXIT («NOMBRE DE LA RECETA» > CARGAR >
OK > SALIR).
Nota: Confirme que en la parte superior
derecha de la pantalla aparece el nombre
de la receta deseado.
Spanish
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Montaje de los Chips
®
Chip de PAGE
y el otro
®
1. Retire la cinta blanca que hay en el lado
del ánodo del Chip.
2. Retire con cuidado la tapa de plástico
del lado del cátodo del Chip.
3. Enjuague suavemente con agua destilada
los pocillos para tampón del ánodo y del
cátodo. Utilizando una toallita de papel,
seque con cuidado cualquier líquido que
pueda haber en la parte superior del Chip
asegurándose de no dañar la fina tira de
gel localizada en el lado del cátodo
del Chip.
Introducción de los Chips en
la bandeja
En la pantalla táctil del dispositivo Auto2D
elija OPEN > OK (ABRIR > OK). Una vez
abierta la bandeja, coloque el Chip de PAGE
(línea azul clara) con el lado del ánodo hacia
delante. Coloque el Chip de disoluciones Plus
(líneas azul oscuro) en la parte superior del
Chip de PAGE con las esquinas recortadas
hacia delante.
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Lado del cátodo
Lado del ánodo
,
®
Spanish