Limitazioni
La creazione dei report e l'interpretazione dei risultati FISH devono essere coerenti con gli
standard professionali procedurali e devono prendere in considerazione anche altri dati
clinici e diagnostici. Questo kit è pensato come aggiuntivo rispetto ad altri test diagnostici di
laboratorio; l'azione terapeutica non deve essere avviata sulla sola base dei risultati FISH.
Il mancato rispetto del protocollo può influire sulle prestazioni e generare risultati falsi positivi
o falsi negativi.
Questo kit non è stato convalidato per finalità diverse da quelle dichiarate nella sezione
sull'uso previsto.
Informazioni aggiuntive
Per informazioni aggiuntive sul prodotto contattare il Dipartimento di Assistenza Tecnica
Cytocell.
T: +44 (0)1223 294048
E: techsupport@cytocell.com
W: www.cytocell.com
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, mit der DNA-Sequenzen auf
Metaphase-Chromosomen oder Interphase-Kernen in fixierten zytogenetischen Proben
nachgewiesen werden können. Dabei werden DNA-Sonden verwendet, die an ganze
Chromosomen oder einzelne, einmalige Sequenzen hybridisieren. Kürzliche Entwicklungen
haben gezeigt, dass diese nützliche Technik nun auch als essentielles diagnostisches
Werkzeug für pränatale, hämatologische und pathologische Chromosomenanalysen
eingesetzt werden kann. Nachdem die zu untersuchende DNA fixiert und denaturiert wurde,
kann die Fluoreszenz markierte, einzelsträngige Sonde daran binden. Nach der
Hybridisierung werden nicht gebundene sowie unspezifisch gebundene DNA-Sonden durch
eine Reihe von Waschvorgängen entfernt und die DNA zur Visualisierung gegengefärbt.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop wird dann die hybridisierte Sonde am Zielmaterial
erkennbar.
Sondeninformation
®
Chromoprobe Multiprobe
OctoChrome™ von Cytocell kombiniert den Nutzen eines
Multisondengeräts mit 8 Quadraten und der Ganzchromosomen-Färbungssonde (in 3
unterschiedlichen Farben markiert), damit alle 24 Chromosomen auf einem einzigen Träger
identifiziert werden können. Das OctoChrome™ Gerät ermöglicht die gleichzeitige Analyse
des gesamten Genoms auf einem Träger in einer Hybridisierung.
Sondeninformation
Jedes Quadrat des OctoChrome™ Geräts enthält Ganzchromosomen-Färbungssonden für
drei unterschiedliche Chromosomen in drei verschiedenen Farbfluorophoren, rot, grün und
blau (Texas Rot-, FITC- beziehungsweise Aqua/DEAC-Spektren), die simultan mit einem
DAPI/FITC/Texas Rot-Dreifachfilter oder spezifischen Einzelfiltern sichtbar sind.
Die Anordnung von Chromosomenkombinationen in dem OctoChrome™ Gerät wurde
entwickelt, um die Identifizierung nicht-statistischer Chromosomenumlagerungen zu
erleichtern, die sich in den häufigsten Leukämieformen finden (Abbildung 1).
Das OctoChrome™ ist für FISH an Metaphasen-Chromosomen aus fixierten kultivierten
peripheren Blutzellen vorgesehen.
Abbildung 1. Standort der Sonden auf demChromoprobe Multiprobe
Kitkomponenten
Jedes Kit enthält die folgenden Reagenzien, die für 2 (PMP 802), 5 (PMP 804) oder 10
(PMP 803) Patientenproben ausreichen:
1.
2, 5 oder 10 Chromoprobe Multiprobe
Painting- Sonden beschichtet sind.
Menge der roten Färbungssonde: 2,5-5ng pro Quadrat
Menge der grünen Färbungssonde: 7,5-12,5ng pro Quadrat
Menge der blauen Färbungssonde: 15-25ng pro Quadrat
2.
4, 7 oder 12 Glasobjektträger, die mit einem speziellen Templat bedruckt sind
3.
500µl Hybridisierungslösung (Formamid, Dextransulfat, SSC)
4.
1 Cytocell Oberflächenthermometer für Objektträger
5.
1 Cytocell Chromoprobe Multiprobe
Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen
1.
Für In-vitro-Diagnostik. Nur zur professionellen Verwendung.
2.
Beim Umgang mit der Hybridisierungslösung, DNA-Sonden und DAPI-Kontrastfärbung
sind Handschuhe zu tragen.
3.
Die Hybridisierungslösung enthält Formamid, das zu den Teratogenen gehört; Dampf
nicht einatmen und Hautkontakt vermeiden. Tragen Sie Handschuhe und einen
Laborkittel und verwenden Sie die Lösung in der Nähe eines Laborabzugschrankes.
Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
4.
DAPI ist ein potentielles Karzinogen. Es ist mit Vorsicht zu handhaben. Tragen Sie
Handschuhe und einen Laborkittel. Bei der Entsorgung mit viel Wasser nachspülen.
5.
Alle gefährlichen Materialien sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien Ihrer
Einrichtung zur Entsorgung von gefährlichen Abfällen zu entsorgen.
6.
Anwender müssen optisch zwischen rot, grün und blau unterscheiden können.
7.
Eine mangelnde Einhaltung des Protokolls kann die Leistung beeinträchtigen und zu
falsch positiven/negativen Ergebnissen führen.
Lagerung und Behandlung
®
Das Chromoprobe Multiprobe
Kit wird bis zum Ablauf des auf dem Kitetikett angegebenen
Haltbarkeitsdatums bei 2-8ºC gelagert. Nicht einfrieren.
Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Ausrüstung und Materialien
1.
500µl Gegenfärbung (DAPI Antifade (ES: 0,125µg/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenyl-
indol))).
2.
Heizplatte (mit stabiler Heizplatte und genauer Temperaturregelung bis 80ºC).
Mikropipetten mit variablem Volumen von 1 µl – 200µl.
3.
4.
Wasserbad mit genauer Temperaturkontrolle bei 72ºC.
5.
Mikro-Zentrifugenröhrchen (0,5ml).
Fluoreszenzmikroskop (siehe auch "Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop").
6.
7.
Coplin-Färbetrog aus Kunststoff oder Glas.
DEUTSCH
®
OctoChrome™.
®
OctoChrome™ die mit direkt markierten
®
Hybridisierungskammer
8.
Pinzette.
9.
Für Fluoreszenzobjektive geeignetes Immersionsöl.
10. Tischzentrifuge.
11. Fluoreszenztaugliche Glasdeckplättchen (24 x 50mm)
12. Timer.
13. Wasserbad mit 37ºC ohne Rührer.
Empfehlungen zum Fluoreszenzmikroskop
Verwenden Sie eine 100-Watt-Quecksilberdampflampe und die Objektive Plan-Apochromat
x63 oder x100 für eine optimale Visualisierung. Verwenden Sie einen DAPI/FITC/Texas Red
Dreifach-Bandpassfilter für eine optimale gleichzeitige Visualisierung der grünen und roten
Fluorophore und DAPI. Das Aqua-Fluorophor weist eine Spezifität für das Aqua und DEAC
Spektrum auf (einfacher Aqua oder DEAC Bandpassfilter wird benötigt).
Das Fluoreszenzmikroskop ist vor der Verwendung zu überprüfen, um sicherzustellen, dass
es korrekt funktioniert. Es ist ein Immersionsöl zu verwenden, das für Fluoreszenzmikroskopie
geeignet ist und für geringe Autofluoreszenz formuliert wurde. Eine Vermischung von DAPI
Antifade mit Mikroskop-Immersionsöl ist zu vermeiden, da dies die Signale verschleiern kann.
Die Herstellerempfehlungen bezüglich der Lebensdauer der Lampe und dem Alter der Filter
sind zu befolgen.
Probenvorbereitung
®
Chromoprobe Multiprobe
OctoChrome™ ist für die Verwendung mit kultivierten peripheren
Blutzellen, die in Carnoy's Fixativ fixiert sind, ausgelegt und sollte nach den Leitlinien des
Labors oder Instituts vorbereitet werden.
Präparieren Sie die luftgetrocknete Proben auf Cytocell Chromoprobe Multiprobe
Templat-Objektträgern gemäß dem folgenden Cytocell Protokoll. Wärmebehandlung oder
Reifung der Objektträger ist nicht empfehlenswert, da dies zu einer verringerten Signal-
fluoreszenz führen kann.
®
Chromoprobe Multiprobe
Protokoll
Bitte beachten: Die mit dem Chromoprobe Multiprobe
direkt mit Fluorophoren markiert und somit lichtempfindlich. Bitte stellen Sie sicher, dass die
Sonde nur in begrenztem Umfang der Strahlung von Laborlampen ausgesetzt ist (es ist
nicht notwendig, im Dunklen zu arbeiten).
1.
Vorbereitung des Objektträgers
a)
Einen Templat-Objektträger reinigen. Den Templat-Objektträger 2 min lang in 100%
Methanol eintauchen und mit einem sauberen, weichen Tissuetuch trockenpolieren.
b)
Korrekten Mitoseindex bestimmen. Der Nachweis von Chromosomenabnormalitäten
ist nur dann möglich, wenn die vorgesehene Probe einen ausreichend hohen
Mitoseindex aufweist. Zur Überprüfung der Dichte der Probe mithilfe einer Mikropipette
(z. B. Gilson P10 oder P20) 4µl der Zellsuspension auf einen der Bereiche des freien
Templat-Objektträgers pipettieren und an der Luft trocknen lassen. Das kleine
Volumen bedeutet, dass der Objektträger leicht mit der Pipettenspitze berührt werden
sollte, um die Suspension zu transferieren. Mittels Phasenkontrastmikroskopie unter-
suchen. Wenn die Zelldichte zu hoch ist, die Suspension mit frischem Fixativ
verdünnen. Wenn der Mitoseindex zu niedrig ist, die fixierte Zellsuspension mit 160xg
10 min lang zentrifugieren. Das Volumen des Überstands notieren, diesen abgießen
und das Zellpellet in einem kleineren Volumen an frischem Fixativ erneut
suspendieren. Nach Änderung der Zellprobendichte 4µl der konzentrierten Probe auf
ein
weiteres
Quadrat
des
Phasenkontrastmikroskopie untersuchen.
Bitte beachten: Für das Protokoll ist ein Mindestvolumen von 50µl erforderlich.
c)
Qualitätskontrolle der Proben. Proben müssen auf Zytoplasma untersucht werden,
da dies das In-situ-Protokoll stört. Wenn die Chromosomen bei der Untersuchung
mittels Phasenkontrastmikroskopie von einem granulösen Material eingeschlossen
zu sein scheinen, können keine exakten Ergebnisse erzielt werden. Eine Methode
zur Reduktion des Zytoplasmas besteht darin, 4µl der Probe auf den Templat-
Objektträger zu tüpfeln und das Fixativ bei der Ausbreitung zu beobachten: Das
Fixativ breitet sich unter normalen Umständen maximal aus, weicht zurück und
verdampft dann. Wir haben festgestellt, dass die Aufreinigung von Zytoplasma
dann am erfolgreichsten ist, wenn in dem Augenblick, in dem das sich ausbreitende
Fixativ seine maximal Ausdehnung erreicht hat, ein frischer Tropfen Fixativ auf den
Flecken fallen gelassen wird. Den Tropfen Fixativ verdampfen lassen und den
Flecken neu untersuchen.
d)
Tüpfeln des Objektträgers. 4µl Zellsuspension in einer Sequenz von alternierenden
Quadraten wie anschließend gezeigt auf alle 8 Bereiche des Templat-Objektträgers
pipettieren. Dies verhindert, dass sich ausbreitende Proben gegenseitig stören.
e)
Nachdem dem Trocknen der ersten Gruppe von Tropfen an Luft 4µl in derselben
Weise auf die restlichen Quadrate tüpfeln. Nach dem Trocknen des Objektträgers
zeigt die Untersuchung des Objektträgers unter Phasenkontrast, ob Quadrate
ausgelassen wurden. Wenn Quadrate nicht getüpfelt wurden oder zu wenig Zellen
aufweisen, diese Quadrate einfach erneut tüpfeln. Das Präparieren eines neuen
Objektträgers ist nicht erforderlich. Wenn ein Quadrat bei der Untersuchung des
Objektträgers zu wenige Zellen/Metaphasen aufweist, können 1 oder mehrere
Tropfen Suspension zugefügt werden, um die Zelldichte zu erhöhen.
Bitte beachten: Wenn die Metaphasen zu stark ausgebreitet erscheinen, wird ein neuer
Templat-Objektträger gründlich in Methanol gereinigt und erneut getüpfelt, wobei jeder
Fleck trocknen muss, ehe der nächste aufgetüpfelt wird.
2.
Vorbereitung von Chromoprobe Multiprobe
Objektträger
a)
Kontrollieren, dass sich die Chromoprobe Multiprobe
37ºC warmen Wasserbad befindet. Kammer auf 37ºC (+/- 1ºC) erwärmen lassen.
Dies kann bis zu einer Stunde dauern, wenn das Wasserbad kalt eingeschaltet
wird.
b)
Hybridisierungslösung durch wiederholtes Pipettieren mischen, und pro Gerät eine
25µl Aliquote auf 37ºC erwärmen. Auch jedes Gerät vorwärmen, indem es mit der
Etikettenseite nach unten auf eine 37ºC warme Heizplatte gelegt wird. Die
erhabenen Oberflächen des Geräts nicht berühren.
c)
Templat-Objektträger, die fixierte Proben enthalten, 2 min bei Raumtemperatur
(RT) ohne Schütteln in 2xSSC eintauchen.
®
®
Gerät verwendeten Sonden sind
Objektträgers
tüpfeln
und
erneut
®
Gerät und Templat-
®
Hybridisierungskammer im
PI008/CE v011.00/2019-04-30
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